产单核细胞李斯特菌溶血素基因的克隆及原核表达.pdfVIP

第30卷 第 11期 中 国 预 防 兽 医 学 报 VO1．3O．No．11 2008 年 11月 ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine NOV． 2008 产单核细胞李斯特菌溶血素基因的克隆及原核表达 张衍海 1,2，白艳艳 ，张彦明 ，郑增忍 ，张 宝 ，童光志 t， (1中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 ，黑龙江 哈尔滨 150001；2．中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032 3．西北农林科技大学动物医学学院，陕西杨陵 712100；4．中国农业科学院上海兽医研究所 ，上海 200232) 摘 要：利用PCR方法扩增产单核细胞李斯特茵(LM)的溶血素基因hlyA，获得一条大小约为 1600bp的目 的片段，将其与pMD18一T栽体连接 ，经酶切、PCR鉴定，命名为pMD18-T—hlyA。测序结果显示所扩增的htya 基因与GenBank中发表的hy／A的序列同源性为 99％。利用含有BamHI／XhoI酶切位点引物B从pMD18一T—hlya 扩增不含信号肽序列的目的片段 B，获得 了大小约为 l500bp的基 因片段 ，该片段与pET32a表达载体经 BamHI／ XhoI处理后进行连接 ，转化BL21受菌体。通过酶切 、PCR鉴定及序列测定后获得 阳性 pET32a．hlyA表达重组 质粒，将重组茵用终浓度为 0．1mmol／L的IPTG进行诱导表达，结果表 明重组茵在诱导2h～3h表达量最高，融 合蛋 白约 占菌体的40％，分子量大小约为80ku；利用LM 的阳性血清进行Westernblot分析，证实该融合蛋 白 可以被 LM 阳性血清所识别，为今后研制针对该蛋白的单克隆抗体和建立间接 ELISA诊断方法提供 了条件 。 关键词：产单核细胞李斯特菌；溶血素；hlyA；克隆；表达 中图分类号 ：Q786 文献标识码 ：A 文章编号 ：1008—0589(2008)11-0870—05 Cloningandexpressionoflisteriolysin0 geneofListeriamonocytogenes ZHANG Yan．hai，BAIYan—yan，ZHANG Yan—ming，ZHENG Zeng—ren。， ZHANG Bao．TONG Guang—zhi， (1．ResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China；2．Animalhealthand EpidemiotogyCenterofChina，Qingdao266032，China；3．CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestAgriculutreandForestry University，Yangling712100，China；4．ShanghaiVeterinaryResearchInstiutte，Shnaghai200232，China) Abstract：ThehlyA ofListedamonocytogeneswasamplifiedbyPCR andclonedintopMD18一T vector．Sequenceanalysis showedthatthehlyA geneshared99％ homologyatthenucleotidelevelwiththepublishedhlyA genesequences．A 1500bp rfagmentofhlyA withoutsignalpeptidewasamplifiedfrom pMD18一T—htya，andclonedintopET32a．Therecombinantexpression 口lasmidpET32a—htya was~ansofrmedtoE．coliandin