人抗氧化蛋白-1在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定.pdfVIP

现代食 品科技 ModernFoodScienceandTechnology 2014，Vo1．30，No．9 人抗氧化蛋白一1在大肠杆菌中的表达、纯化及 活性鉴定 毛爽 ’，陈少沛 ’，颜晟 ，王海鹰 ，宁正祥 ，李杉 ’，王菊芳 。 (1．华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006)(2．华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510006) 摘要：为得到较纯的具有活性的人抗氧化蛋白Peroxiredoxinl(Prx1)，本文先用PCR的方法扩增了人Prxl的eDNA序列，然 后将其连接到pET28表达载体上，从而构建了编码全长的人抗氧化蛋白．1基因的pET28．Prxl原核表达质粒。经双酶切及测序鉴定后 将表达质粒转~：-,k3Ph杆菌BL21(DE3)进行表达，并通过SDS．PAGE和westernblot来鉴定表达产物。随后用Ni_NTA螯合亲和层析 的方法纯化重组蛋白，并测定该酶的米氏常数，用质粒保护实验鉴定该蛋白其活性。最终表达载体经酶切和测序鉴定证实构建成功， 表达产物在SDS．PAGE和westernblot图的25kD左右，与prxl真实的蛋白分子量相符，说明Prxl蛋白成功表达。Prxl纯化后产量 达到7．59mg／g茵体，纯度达到88．50％。纯化后的Prxl在 37℃和pH7．4的条件下催化H202反应的米氏常数Km为2．06x10molL／， 质粒保护实验表明Prxl可以保护pUC18质粒免受氧化损伤。因此，Prxl在大肠杆菌中成功表达并得到较纯的活．I}生蛋白。 关键词：抗氧化蛋白1；重组表达；亲和层析；蛋白印迹法；氧化损伤；质粒保护实验 文章篇号；1673．9078(2014)9．55．59 DOI：10．13982~m．fst．1673·9078．2014．09．010 PurificationandActivityofHumanPeroxiredoxin1ExpressedinE coli M AO Shuang，CHEN Shao-pei1YAN Sheng1WANGHai-yingzNINGZheng-xiangzLIShanlWANG Ju—fangl , ， ， ， , (1．SchoolofBioscienceandBioengineering，SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006，China) (2．SchoolofLightindustryandFoodSciences，SouthChinaUniversiytofTechnology,Guangzhou510006，China) Abstract：Inordertoobtainactivehumanperoxiredoxinl(Prx1)withhi曲purity,PrxleDNAsequencewasamplifiedbypolymerase chainreaction(PCR)，clonedniexpressionvectorpET28toconstructaprokaryoticexpressionplasmidpET28-Prxl，containingfull-length humanPrxlgene．AfterendonucleasedigestionnadDNAsequencing，theplasmidwastransferredintoEscherichiacoliBL21(DE3)for expression．Theexpressionprodu~was identifiedbysodimu dodecylsulfatepolyacrylmaidegelelectrophoresis(SDS)andwestern blotting．Therecombninatproteinwaspurifiedbynickel—nitrilotfiaceticacid(Ni-NTA)affinitychromatography,hteMichaelisconstant(Km)o