铁在谷氨酸兴奋性毒性中与重要作用及运动神经元保护机制研究.pdf

中文摘要 铁在谷氨酸兴奋性毒性中的重要作用及 运动神经元保护机制研究 摘 要 肌萎缩侧索硬化(ALS)是中枢神经系统常见的一种慢性神经退行性 疾病，以脑和脊髓中选择性的运动神经元变性为特征，临床表现为缓慢起 病，进行性发展。ALS是一种致死性疾病，患者多在首次出现症状后的 3～5年内死亡。目前，该病病因不清、发病机制不明、缺乏有效的治疗方 法。目前证据提示ALS运动神经元的丢失是由于一些复杂的相互作用的 机制所致，包括氧化应激、兴奋性毒性作用、细胞骨架异常和蛋白聚集以 及遗传因素等。诸多研究表明这些机制之间并不是相互排斥的，在最终导 致ALS的运动神经元死亡的不同机制中氧化应激可能起中心作用。 生过多引起的细胞损伤。神经系统氧耗量大，多不饱和脂肪酸含量丰富， 抗氧化能力相对较弱。与其他器官相比，神经系统更易受到氧化损伤。中 枢神经系统含有非血红素铁，并且在特定部位如黑质和基底节中铁含量非 常丰富。诸多研究表明，铁与氧化应激关系密切。铁离子如果不能以适当 方式与蛋白或其它配体结合，其可以通过Fenton反应催化形成具有代谢 毒性的ROS，攻击生物大分子，从而引起神经元变性。大量临床研究发 现，在多种神经退行性疾病中都存在氧化应激和异常铁积聚的现象，如包 括帕金森病和阿尔茨海默病在内多种神经退行性疾病病人脑内呈现病理 性、区域性铁沉积。据此我们推测，铁过载导致的氧化应激在ALS的发 病中可能发挥重要作用。 我们应用谷氨酸转运体抑制剂苏．羟天冬氨酸(THA)诱导的脊髓体 外器官型培养谷氨酸兴奋性毒性模型，探讨铁在谷氨酸兴奋性毒性中的作 用，以及绿茶多酚EGCG和莱菔硫烷(SF)对运动神经元的作用和机制。 采用免疫组织化学方法观察运动神经元的数目和形态，用Westemblot方 法检测标本蛋白水平的变化，用多功能酶标仪检NSL酸脱氢酶、丙二醛和 谷氨酸的变化。研究发现，在谷氨酸兴奋性毒性模型中，转铁蛋白受体和 二价金属离子转运体蛋白表达升高，铁蛋白表达降低，组织内总铁含量增 中文摘要 加，氧化应激水平升高，运动神经元数目减少，给予铁螯合剂去铁敏可以 有效阻止THA导致的氧化应激，保护运动神经元。绿茶多酚EGCG作用 机制复杂，我们研究表明，EGCG可以通过降低细胞间隙的谷氨酸来对抗 THA引起的兴奋性毒性，减轻氧化应激，保护运动神经元。莱菔硫烷是 一个非常有效的II相酶诱导剂，在肿瘤研究中，诸多学者对其进行了深入 地探讨。我们发现莱菔硫烷可以通过诱导II相解毒酶有效对抗THA引起 的运动神经元死亡。另外，我们对谷氨酸兴奋性毒性模型进行了深入地分 析研究，为进一步应用此模型进行实验研究夯实了基础。通过上述一系列 实验研究，我们阐明了铁在谷氨酸兴奋性毒性中的重要作用以及EGCG 和莱菔硫烷通过不同的机制保护运动神经元。这对于研究肌萎缩侧索硬化 的发病机制和筛选有效的治疗药物提供了坚实的理论依据。 第一部分铁在谷氨酸兴奋性毒性中的重要作用 目的：在脊髓体外器官型培养谷氨酸兴奋性毒性模型中，观察铁转运、 储存蛋白和铁含量的变化，并且应用铁螯合剂去铁敏，观察其对运动神经 元是否具有保护作用。 方法：应用脊髓体外器官型培养模型，随即分成3组：对照组、THA 组和DFO+THA组。应用Westernblot方法检测铁转运和储存蛋白水平的 变化，用原子吸收光谱法测量组织中铁含量的变化，用免疫组化方法检测 运动神经元数目，用多功能酶标仪检测组织中丙二醛的变化以及培养液中 谷氨酸和乳酸脱氢酶的变化。 结果：1009mol／L 蛋白表达升高，而Ft．H蛋白表达下降，组织中总铁含量增加。给予铁螯 合剂DFO可以有效阻止THA引起的兴奋性毒性，保护运动神经元。但是 DFO对于培养液中的谷氨酸没有影响。 结论：铁在谷氨酸兴奋性毒性中起到重要作用，螯合铁可以有效阻止 谷氨酸兴奋性毒性引起的运动神经元损伤。 第二部分绿茶多酚EGCG对运动神经元的保护机制探讨 目的：探讨绿茶多酚EGCG对运动神经元的作用和机制，为寻找肌 萎缩侧索硬化的治疗药物提供理论依据。 方法：应用脊髓体外器官型培养模型，随机分成3组：对照组、THA 中文