有益菌A18菌株铁载体与研究和铁吸收调节蛋白（Fur）基因与克隆和表达.pdf

有益菌A18菌株钬载体的研究和铁吸收蒯节盗臼{Fur)皋然J的克隆和表达 有益菌A1 8菌株铁载体的研究和铁吸 收调节蛋白(Fur)基因的克隆和表达 摘要 利用甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸钠、溴化乙啶(EB)和紫外线(UV)对海洋有 益细菌A18(爿，teFOmOn昂Gaurm，tia)进行复合诱变，得到一株铁载体高产菌株 J6132l。对J61321抑菌活性[以鳗弧菌w一1(Vibrioanguillarum)作为指示菌]、 所产铁载体的种类以及其性质进行了研究，结果显示出发菌株A18及突变株 361321所产铁载体均属于异羟肟酸类，而指示菌w一1所产铁载体为儿茶酚类；突 变株J61321在铁载体产量、抑菌活性、对沸水浴的耐受性以及抗铁螯合剂方面都 优于出发菌株k18。对铁载体高产菌株j61321的生长和产铁载体的液体培养条件 源、氮源)和培养条件(起始pH、培养温度)进行了优化研究，最终得到突变株 0．001％(w／v)，培养温度284C，摇床转速180rpm，pH7．5，在生长204,时后铁载体 达到最大产量。研究了A18和361321菌株的生长量(OD。。。)、铁载体产量和抑菌活 性随培养时间的变化，结果显示二者的生长量差距不大(pO．05)，铁载体产量和 抑菌活性之间存在显著性差异(pO，05)。 利用有机溶剂萃取法和大孔径树脂吸附法两种方法分别提取铁载体粗品， 经HPLC初步分离，收集抑菌活性和CAS检测结果均为阳性的组分。利用高效 液相色谱／二极管阵列检测／质谱法对活性组分进行再次分离，采用ESI—MS，采 集正离子质谱数据，根据分离组分的分子离子峰推测组分I为铁色素，组分II 为铁草铵(ferrioxamine)。 以橙色交替单胞菌Alsee提取的染色体DNA为模板，根据革兰氏阴性菌胁同 源性设计的上下游引物，通过PCR技术扩增到A18的细r基因。将PCR产物克隆到T 载体上，转化大肠杆菌JMl09，筛选阳性克隆进行DNA序列分析，结果表明PCR扩 增的DNA片段编码148个氨基酸，与GenBan时睫道的革兰氏阴性菌的相应序列同源 sp0--7的相似性 性很高(与大肠杆菌的Fur蛋白的相似性为70％，与』，telomoRas 为97％)，通过在线结构模拟，发现其结构与已经报道的Fur蛋白的结构相同。将 有益菌A18苗株铁载体的研究和铁吸收调节蛋白(Fur)基因的克隆和表达 橙色交替单胞菌血，基因克隆到非融合表达载体pOE]2，构建表达质粒pQE—fur， 条件下，通过IPTG诱导表达的Fur蛋白可以抑制铁载体盼合成和分泌。 关键词：海洋有益菌；铁载体；复合诱变；铁吸收调节蛋白；结构模拟 有箍菌AI 8菌株铁载体的研究和铁吸收调节蛋白(Fur)基因的克隆和表达 l nvesti onthe gation froma SiderophoreProbiotiCS BacteriaIStrainA18 and and 0Ioning。Sequencing i onofthe Express 6eneofFerr i I ator c—uptakeRegu Abstract A mutantstrainnamedJ61321wasobtainedfrom highsiderophore-producing themarine bacterialstrainA18“lteromonas aseriesof probiotic