pucC超表达对Rhodobacter+sphaeroides光合细菌表达体系异源蛋白表达水平与影响.pdfVIP

中文摘要 摘 要 目前应用的外源蛋白表达系统有原核表达系统、真核表达系统等。这些表达 系统都存在各自的缺陷，尤其在生产重组蛋白提取前快速实时检测方面存在技术 空白。光合细菌表达系统是本实验室正在研究的新型表达系统。 类球红细菌Rhodobacter sphaeroides是研究光合作用和膜蛋白的模式生物，在 特定的生长环境下，类球红细菌的细胞质膜(CM)会自动内嵌形成胞质内膜系统 学反应中心(RC)在此得到大量表达。其中LH2由九对Oc、B亚基组成，0【亚基 和一分子Crt形成有功能的LH2复合物，有功能的LH2在800nlTl及850nlil有特 征光谱吸收，并且LH2复合物的表达量越高，其相应800nnl和850nlrl的特征光 谱吸收峰值越高，因此，当异源基因与pucB基因或pucA基因形成融合基因，经 诱导表达形成LH2 u一异源蛋白时，我们就可以通过检测诱导后 13-异源蛋白或LH2 菌体特征光谱吸收峰的高低，实时定量检测LH2及融合表达的异源蛋白表达量的 多少。但是外源蛋白表达系统中，LH2、LHl及RC都属于膜蛋白，蛋白表达量低， 因此表达外源蛋白的水平较低，这在很大程度上限制了光合细菌表达系统的应用。 如果能够找到一种能使其外源蛋白表达量提高的方法，将对这一新型表达系统的 广泛应用具有重要意义。 亚基、B亚基进入内膜系统，进行正确的装配，pucC基因缺失会导致不能形成有 功能的LH2。因此在本研究中，我们将外源基因gus与含有杂合启动子 因表达载体，同时，在构建好的异源基因表达载体上，我们将pucC基因超表达， 成功构建了pucC基因超表达载体。然后通过S17一l的作用，将构建好的表达载体 及对照通过结合转移的方式导入双缺失突变体CQU68中，在低氧及IPTG存在的 条件下，成功诱导表达了LH2、LH2 13-GUS融合蛋白。通过pucC基因荧光实时定 量PCR分析、菌体及总膜蛋白的近红外光谱吸收分析、目的蛋白SDS—PAGE和 Westem 量明显高于pucC未超表达菌体的目的蛋白表达量。即，通过pucC基因的超表达， 可以使外源目的蛋白的表达量升高。 本文通过将pucC基因超表达，有效提高了异源蛋白的表达水平，为将来光合 细菌新型表达系统广泛应用于异源蛋白表达领域，奠定了一定的基础。 关键词：类球红细菌，pucC超表达，异源蛋白表达 ． 重鏖奎堂堡主堂笪笙塞—— II 英文摘要 ABSTRACT Thereare usedfor at manysystems heterologousproteinexpressionpresent， includingprokaryoticexpressionsystem，eukaryotic et expressionsystema1．However, allofthese show thelack systems ofreal—timedetectionof defects．especially recombinant to hasbeen thatRb proteinpriorproteinpurification．Itreported couldbe asanovelhostto membrane sphaeroidesemployed functionallyex