多重PCR检测禽流感病毒血清亚型研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集 ·禽流感· 多重PCR检测禽流感病毒血清亚型的研究 刘惠莉，邢继兰，周宗清，陈波，潘洁 (上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106) ． 守区设计引物，sPCR筛选出引物对。用于血凝素和神经氨酸酶亚型鉴别。根据NP、H5N1、H9N2亚型引物扩增片段大小不同， 反应条件的差异，将各引物配比组合，形成不同的配组，建立多重PCR体系，经对不同亚型模板的检验，建立的两个多重PCR 体系可用于AIV及H5／H9血凝素亚型、N1／N2神经氨酸酶亚型的快速鉴别、诊断。 [关键词]禽流感病毒#血凝素亚型；神经氨酸酶亚型}多重PCR 1．3 RT—PCR技术已成功用于禽流感病毒实验室 诊断，根据NP基因序列，设计合成针对保守区引 反转录酶、rTaq酶及Buffer等均购自大连宝生物工 物，用于病毒核酸鉴定。利用NP基因可鉴定出 程公司(TakaRaCo．，) 一 1．4 AIV，但无法明确病毒血清亚型，还需进一步采用血 RNA提取按照说明书进行 凝或血凝抑制试验鉴定。 1．5H5／H9血凝素亚型、N1／N2神经氨酸酶亚型单 多重PCR是在单一PCR基础上发展起来的新一RT—PCR体系建立 技术，通过寡核苷酸引物组合，在一个PCR反应体 反转录：在20弘L体系中，按比例加入反转录 系中同时扩增多个靶序列，其扩增的特异性和效率 与单一PCR相当，但同时可扩增针对不同模板的多 板，用DEPCH20调整体积至20弘L，反转录。 个靶序列，能节约时间和精力，在样品的鉴别诊断中 PCR扩增：在25肛L体系中，分别按比例加入 是一项简便、快速的方法，尤其适用临床病原分型检 H5、H7亚 测，国外报道的多重PCR鉴别诊断AIV 应产物(cDNA)模板，用灭菌H。O调整体积至 型，及针对SIVH1N1、H3N2亚型的分型检测， 25弘L。进行PCR扩增，反应完毕，取5—10pL样品 ChoiY．K．等采用两个PCR体系，建立能区分流感电泳，观察结果。 病毒H1N1、H1N2、H3N2血清亚型的分子检测方1．6H5／H9 HA亚型、N1／N2NA亚型多重PCR 法，在一个反应体系中可同时鉴定两个不同亚型，具 体系组合 根据不同亚型扩增结果，选择NP／H5／ 有比单一PCR非常明显的优势。我国目前流行的 H9引物、N1／N2引物进行配比组合，构建多重PCR AIV血凝素(HA)主要为H5、H9亚型，神经氨酸酶 体系。按一定比例混合H5、H9亚型病毒RNA，反转 (NA)为N1、N2，因此建立针对这两种亚型的快速、 录，再以此反转录产物做模板，进行多重PCR反应， 灵敏检测方法非常必要而且实用。 体系中加入不同的引物组合。反应完毕，取样电泳， 观察结果。 1材料与方法 1．1各亚型禽流感病毒核酸：由本室保存备用。 2结果 。 1．2引物设计、模拟PCR筛选及合成下载 2．1引物筛选 Genbank登录的AIVNP基因、H5N1亚型、H9N2 亚型的HA、NA基因，用Dnastar软件进行类比分 个、H5亚型HA基因模板序列7个；H9亚型HA 析，筛选决定不同亚型的保守区域，软件Primer3．0模板序列5个，用于比对和引物设计、筛选。 设计分型引物，引物由上海申能博彩生物工程公司 经设计、模拟