多重PCR快速检测鉴别奶牛乳房炎三种主要病原体研究.pdfVIP

牛羊马传染病 了多重PCR技术检测皮肤组织中的羊痘病毒。这比用单一引物PCR方法有更高的敏感性和 特异性，这是一种简单、快速、准确且特异性强的诊断方法，可在24h内对样品作出检测， 但该方法偶尔会出现一些假阴性结果。我国的郭巍等(2003)根据编码核衣壳蛋白P32基因 以及Q．微管蛋白基因序列，设计两对引物，成功地从病毒DNA中扩增P32基因和微管蛋 白基因，经序列测定，发现扩增出P32基因与Oenbank上序列同源性达98％，表明建立的 PCR诊断方法是完全可以用于山羊痘的诊断。 参考文献略 多重PCR快速检测鉴别奶牛乳房炎三种主要病原体的研究 谢志勤，谢芝勋}，唐小飞，刘加波，庞耀珊，邓显文，朱贤龙 (广西兽医研究所，南宁，530001) 摘要：奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疫病，目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要 致病原的方法．本试验根据金黄色葡萄球茵、无乳链球菌、大肠杆茵各自保守的16S或23SrRNA基因序 列，合成了三对特异性引物，建立了三重PCR检测方法．其扩增片断大小分别为金黄色葡萄球茵1319bp， 无乳链球菌406bp，大肠杆菌663bp．特异性试验表明，谈方法对所有参与测试的金黄色葡萄球茵、无乳链 球菌和大肠杆茵都能扩增出各自的阳性条带，而对所有参与测试的对照菌株则不能扩增出任何条带．敏感 性试验表明该方法能检测到4个菌的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和2个菌的大肠杆茵的DNA模板．对送 检的乳房炎奶样36份直接进行PCR检测，金黄色葡萄球茵有阳性7份，无孔链球菌阳性2份，大肠杆茵 阳性6份． 关键词：奶牛乳房炎；多重PCR；金黄色葡萄球菌；无乳链球菌；大肠杆菌． 奶牛乳房炎是奶牛最常见的疾病，是造成奶牛生产经济损失的重要原因之一。它不仅影 响奶牛的产奶量，使成本增高从而降低奶牛养殖经济效益，同时影响牛奶的品质，危害人类 健康。据我国北京、上海、广州、西安、兰州等城市调查，奶牛乳房炎是奶牛场最严重的疾 病之一，发病率达20．30％，据国外报道，奶牛乳房炎的发病率约为25．60％，在北美因奶牛 乳房炎每年造成的损失达数十亿美元。 乳房炎一般分为临床型和隐性型，临床型乳房炎可见明显的临床症状，如泌乳量下降， 乳房肿胀，乳汁性状异常等。隐性乳房炎的乳房和乳汁无肉眼可见变化，但乳腺组织已发生 了病理变化，乳中体细胞数升高，但因不表现临床症状而常被忽视。目前报道引起奶牛乳房 炎的原因很多，尤以病原菌引起最为普遍，其中最主要的三种病原菌为大肠杆菌，无乳链球 菌和金黄色葡萄球菌。国内外检测鉴别这三种病引起的奶牛乳房炎的报道较多，如病原分离 鉴定链球菌【l#≯J，酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴别金黄色葡萄球菌14J等，但是这些方法耗 时、费力，确诊时间周期长，而PCR方法具有快速、准确、敏感和特异的特点。本研究应 用三对分别扩增三种奶牛乳房炎主要病原体的特异引物，建立了一次PCR能同时广泛用于 动物病原体的检测鉴别，但未见有应用多重PCR同时快速检测鉴别奶牛乳房炎主要病原体的 报道。现将方法介绍如下。 1材料与方法 1．1试验毒株及主要试剂 牛大肠杆菌标准株C83287、牛无乳链球菌标准株C55901，对照用的牛布鲁氏菌A387、 牛结核分枝杆菌BGC、牛副结核分枝杆菌、巴氏杆菌C48．1购自中国兽医药品监察所，金 黄色葡萄球菌分离株、链球菌分离株、大肠杆菌分离株以及对照用的牛化脓棒状杆菌、牛变 形杆菌由本室分离并保存。感受态细胞DH5。由本室制备并保存。PMDl 8．T质粒载体、Taq 聚合酶、T4 I、Xba DNA连接试剂盒、dNTP、限制性内切酶PstI等购自大连宝生生物工 程有限公司，小量质粒提取试剂盒，胶回收纯化试剂盒购自上海生物工程有限公司；其他试 剂均为进口或国产分析纯试剂。 第六届理事会第二次会议鼙教学专业委员会2006年会议论文集 1．2细菌的培养 大肠杆菌、葡萄球菌接种于普通马丁汤或血液固体培养基，链球菌接种于含有5％羊血 清的马丁汤或血液固体培养基，37℃培养过夜。收集菌液并分装于1．5ml离心管，10，000rpm 离心10分钟，收集沉淀的细菌保存备用或供抽提DN