生物素-亲和素体系固定分子信标的超灵敏光学DNA生物传感器研究.pdfVIP

生物素．亲和素体系固定分子信标的 超灵敏光学DNA生物传感器研究 李军，王柯敏+，谭蔚泓． 肖丹，何晓晓，唐志文，羊小海 湖南大学化学纯I学院．410082，长沙 ． 与传统的分析方法相比，DNA生物传感器在获得DNA序列时快速、简单的方式 使它具有良好的发展前景。然而目前的荧光生物传感器的有几个方面的局限，如需要 。 对目标物进行标记或需嵌入剂来扩大响应信号，以致无法实现在线监测样品中DNA的 含量。 利用分子信标作为荧光探针的光导纤维DNA生物传感器使得实时研究杂交过程 和在界面上监测杂交动力学”过程成为可能。分子信标是一种含有发夹结构的单链低 聚核苷酸3。荧光团和猝灭剂分别被连接在柄的两端，互补链使这两部分靠近井以能量 转移方式引起荧光团的猝灭。当遇到目标DNA时，分子信标与之杂交发生构象变化， ， ．这会迫使柄状结构分离并导致荧光恢复。目前，把低聚核苷酸固定在固体表面最普通 的方法是有共价键结合和亲合素．生物素结合两种方法。由于分子信标末端分别和荧光 团与猝灭剂连接，所以亲合素．生物素结合法是分子信标固定化最方便的策略。本文中， 生物素化分子信标被设计用来制备光学DNA生物传感器。分子信标探针用氮．氖倍频 激光器激发并用E600荧光显微镜(卜耻onJap髓)系统收集荧光信号．DNA生物传感器 的实时响应由荧光分光光度计上的光电倍增管记录下来。 生物索化的牛血清蛋白首先被吸硝在盖玻片上，亲合素与之结合并固定在盖玻片 上，由于亲合素与生物素间有四个结合位点，因此固定化的亲合素可用另外的结台位 点与生物素化的分子信标结合。这样，亲合素在玻璃表面和生物素修饰豹分子信标之 ． 间就象桥一样将二者连结。用这种方法构造的传感器其响应很快并且荧光增强效率提 高达2．7倍。这种现象可解释为桥式结构降低了目标DNA与生物素化的分子信标结合 的位阻。于是目标DNA在到达传感器表面后可很容易与固定化的分子信标结台。 ‘}通讯联系人}湖南大学化学化工学院，长沙410082．Tel：0731-882,2．701·Ficx：0731—882452,5 Emai l．hunu．edu．cn l：J口_目1昙●hai 119 我们同时发现对相同大小的盖玻片，即使所用的分子信标含量不同，其最终荧光强 度是相似的。这表明如果固定过程是不变的，则在盖玻片上亲合素的数量可能是相似 的。但初始反应速率与互补低聚核苷酸的浓度成正比，因此初始反应速率被用来确定 杂交动力学性质，杂交速率随目标低聚核苷酸的浓度增加而增加。传感器的线形响应 范围为5．125n_M。检测限达2nM。初始反应速率与目标低聚核苷酸浓度间的良好的线 性关系表明分子信标与cDNA的结合是一级反应。 单点基因突变常被用来诊断基因疾病，而分子信标对识别低聚核苷酸序列中碱基 变化的能力是十分明显的。研究发现对于不互补DNA．传感器的信号没有明显的荧光 增强。当用单碱基不匹配的-DNA时，只获得微弱的荧光增强。这表明双螺旋结构形成 了但不稳定。可咀看出，由于分子信标的发夹结构的存在，分子信标的选择性比线性 探针要高。 可重复使用的生物传感器在实际应用中是非常重要的。DNA传感器的再生一般 可通过浸入热水和浓尿素溶液中实现。但加热的方式会引起生物索化的牛血清蛋白和 亲台素的变性i因此20％尿素溶液被用于分子信标DNA生物传感器的再生。经过再生 的分子信标柄状结构重新形成，荧光值又回到其初始状态。当再生的生物传感器与目 标DNA杂交时同样会发生相似的荧光增强现象。但荧光强度的增强比例不能达到上一 次测量时的水平。我们推测其主要原因是因为使用后分子信标的发夹形结构不能完全 恢复。 资助。