细菌外膜功能蛋白质组学研究的论文.pdfVIP

细菌外膜功能蛋白质组学研究 彭宣宪 (厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 革兰氏阴性细菌的外膜蛋白处于与外界自然环境的交界处，在应对外界环境因子中起着 重要的作用。‘因此研究细菌的外膜蛋白，了解环境因素对其表达的影响具有重耍理论和实际 意义。 我们在国内较早(1999年)进入蛋白质组学研究领域，主要从事细菌膜功能蛋白质组 学的研究。现将部分研究结果报告如下。 细菌外膜表达蛋白质图谱的建立：采用表达蛋白质组学方法，建立了大肠杆菌、铜绿 假单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和荧光假胞菌等6种革兰氏阴性病原菌外膜蛋 白的表达图谱，其中刨伤弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和荧光假单胞菌的图谱为国内外首次 建立。在证明有关学者提出的PMF方法完全适合于已完成基因组全序列测定的微生物蛋白质 鉴定的基础上，建立了一种通过对部分已知蛋白模拟酶切及鉴定、双向图谱比较以正确选择 PMF检索范围的技术路线，用于未完成全基因组测序的微生物种类的鉴定，并在溶藻弧菌外 膜蛋白质组鉴定中得成功的应用。进一步以大肠杆菌K12为重点研究对象，分析了膜蛋白月 桂酰肌铵酸钠(sarcosine)不可溶部分和可溶部分的蛋白质双向电泳图谱，获得184个蛋白 点，归属于104种蛋白，其中32种为细菌外膜蛋白，是迄今为止该细菌外膜蛋白鉴定数量最 多的报道。同时发现，在月桂酰肌铵酸钠的可溶部分中，约40％为酶类，其中大多与糖原代 谢途径有关。外膜蛋白可与酶形成蛋白一蛋白复合物。 ， 细菌外膜比较功能蛋白质组学的研究：在建立上述表达图谱的基础上，通过比较蛋白 质组学和相关分子生物学技术，较系统地研究了细菌对铁离子、抗生素、盐度、温度、pH、 去污剂等多种环境因素变化反应以及免疫原性的外膜功能蛋白质组。我们的研究内容包括 1)采用比较蛋白质组学技术筛选和鉴定差异蛋白质，2)差异蛋白质基因的克隆、原核表达 和多克隆抗体制备，3)采用Western blotting技术对差异蛋白进行确认，4)采用基因过表 达和敲除技术对差异蛋白(基因)进行功能鉴定，5)差异蛋白的蛋白一蛋白复合物的组成 和功能研究。以下以盐调节、铁离子调节和耐药外膜功能亚蛋白质组的研究为例进行介绍： 1．OmpW和OmpV是一对重要的盐调节蛋白；海洋病原菌不仅对水产养殖造成巨大 的经济损失，而且对人类健康形成一定的威胁。对不同盐度环境的适应能力是海洋病原微生 物的一种基本机能，同时这也与细菌致病能力及繁殖传播能力紧密相关。我们较系统地研究 了副溶血弧菌、溶藻弧菌、美人鱼发光杆菌外膜蛋白的盐调节功能，率先证明OmpW和OmpV 的盐调节功能，其中前者随NaCI浓度升高而表达是增加，后者随NaCI浓度升高而表达量 下降。分子克隆和生物信息的研究结果表明，美人鱼发光杆菌与副溶血弧菌和溶藻酸弧菌的 OmpW基因具有高度同一性；与副溶血弧菌的OmpV基因也具有高度同一性：而与霍乱弧 能力。对OmpW和OmpV基因敲除的副溶血弧菌以3种细菌的相应基因进行基因互补 (complementation)试验，证明互补后，其盐调节功能得到恢复。进一步采用Western blotting 技术，研究了副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、美人鱼发光杆菌、非01霍 乱弧菌、弗尼斯弧菌、河弧菌和麦氏弧菌、大肠杆菌K-12和嗜水气单胞菌等11种细菌OmpW 和OmpV的分布和表达规律。结果表明，OmpW和OmpV较普遍存在于弧菌中，对盐浓度 变化比较敏感。同时发现，OmpW的表达量与细菌的盐耐受性呈正比，即能够高表达OmpW 的细菌其对盐的耐受性明显高于低表达菌。而OmpV的表达量则与细菌的盐耐受性呈反比。 17 这些结果提示，OmpW和OmpV是一对具有明显生物活性的渗透压调节蛋白，具有基因多 样性和表达多样性的特点，与细菌盐耐受能力密切相关。 2．OmpW和Tsx是细菌低铁环境下生长的负调蛋白：铁离子是细菌生长的必需成分。 革兰氏阴性细菌外膜蛋白在细菌克服低铁不利环境中起重要作用。我们采用比较蛋白质组学 技术，研究了大肠杆菌K12在铁离子限制的LB培养基培养下外膜蛋白质组