半定量RT—PCR法检测原代培养脂肪细胞生脂基因MRNA转录表达.pdfVIP

维普资讯 半定量 RT—PCR法检测原代培养脂肪细胞 生脂基 因mRNA转录表达 卢建雄 。‘，臧荣鑫 ，‘潘和平’，杨具 田。，陈粉粉 ，杨公社 (1．西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730030；2．西北农林科技大学动物脂肪沉积和肌肉发育实验室) 摘 耍：在原代培养脂肪细胞生脂机制研究中，为了检测生脂基圆ACCI和 FASmItNA表选水平变化．如 胞总 RgIA经反特录合成eDNA．以13一aetin为 内参照．分别与 AC(21和 FAS等基 圆同管扩增。通过探讨和优化 PCR体系中引袖设计 、退欠温度 、l~IgCl采度和循环次数等参数 ，以厦引精时间的扩增竞争 ．建立了检洲脂肪细胞 生腊相关基 因mRI~A表达的半定量多重RT—PCR体系。结果显示 ，RT—P(IR产物经电泳后 ．13一actin厦生膳基 因电泳带清晰．与预期产轴大小一致 ，引物时间无扩增竞争．其扩增效率和特异性与单重 RT—PCR体 系相 同．实 验重复性好。 目此 ，谊方法和体系可用于快速 、灵敏 、可靠地检洲特异基因mRI~A的表达。 关麓词 ； 原代培养脂肪蛔胞 ：生脂基 因：半定量 RT—PCR 中圈分类号 ：$852．2 文献标识码 ：A 文章墒号 ：1000—6354(2005)O6 O016—03 脂肪组织是动物重要的贮能器官 ．它通过脂肪的生成和 剂盒、TaqDNA 聚合酶、反转录试剂盒、DNAladdermarker、 水解调控机体能量平衡 。许多因素引起 的脂肪细胞胰岛素 DEPC均购 白Ferment~公司；高速冷冻离心机 、微量取样器 抵抗及脂解产生大量游离脂肪醴 等是人类 2型糖尿病发生 胸自eppendorf公司 ；PTC一200梯度 热循环仪 ．MJIlese6aeh 和发展的主要诱因 。此外．脂肪细胞还产生和分泌如肿瘤坏 公司；紫外分光光度计 ．unic公司；凝胶成像系统及 Dophin一1O 死因子n(Tuii~ornecrosisfactor—q，TIW —a)等许多以自／旁分 凝胶 分析软件为 Wesltee公 司生产 ；CO 培养箱 ．REVCO公 泌或内分泌方式起作用的脂肪源性激素或 因子．调控机体多 司 种代谢过程 0。因此 ．研究脂肪细胞脂代谢相关基因转录调 1．2 方 法 控对于阚明人类2型糖尿病发病机理 ，调控动物体脂沉积和 12．1 原代脂肪细胞培养及处理 雄性sD大鼠断颈处死 ． 改善动物产品质量有重要意义。 无菌条件下取腹股沟、附睾远端 、肾脏周 围的白色脂肪组织 ． 在基因转录调控研 究中，需要定量分析在不同实验条件 按林亚秋等 描述的方法消化、过筛，以5x10‘个细胞／era 下特定mRNA转录和表达水平 的变化 。目前有许 多先进 的 密度接种到6孔细胞培养板 ．在 DMEM+10％胎牛血清的培 mltNA定量方法和技术 ，如 实时定量 PCR(RT—PCR)和 养泼中，3711、5％CO 培养 ，24h后换不 同处理 的蜡菲渡 ．培 Northenb|ot等，但它们对设备的要求普通实验室不易达到 。 养48h后提取细胞 RNA。 井存在放射性污染等缺陷 。此外，尽管对实验研究而言． 1．2．2 细胞总 ltNA提取 吸出6孔培养板中的培彝液 。每 结果必须有好的重复性和精确性 ．但多数研究 的焦点并不是 孔加rRLzollm1．按说明书提取细胞总RNA，提取的RNA溶 检测转录水平微小的变化或确切 的分子数 目，而是检测其表 解在适量无RN舳e的 DEPC水 中，l％甲醛变性凝胶 电泳．EB 达水平变化是否显著 。所 以．半 定量分析mRNA水平相对变 染色．紫外光下观察ltNA完整性和有无 降解及基 因组 DNA 化能够满足许多研究的要求 ．但设置多重 PCR反应体系是 污染