单核细胞增生李斯特氏菌的PCR检测方法.pdfVIP

选 墼 单核细胞增生李斯特 氏菌的PCR检测方法 徐宝梁 贾建会 陈 颖 赵贵明 苏 宁 吴亚君 1(中国进 出 1]【商品检验技术研究所 ，北京，100025) 2(北京市食 品研究所 ，北京，100076) 摘 要 研究 比较 了裂解法 、热煮沸法 、试验盒法提取单增李斯特 氏菌DNA 的效果 ，认 为 Promega 试剂盒法提取的DNA，得率高 、纯度好。同时根据单增李斯特 氏茵的毒力相关基因的5对引物，进 行了引物的特异性研 究，结果发现 inA[ 引物、intB引物、picA 引物特异性好，可 以用于食 品中单增 李斯特 氏菌 的检测。 关键词 单核细胞增生李斯特 氏菌 ，聚合酶链式反应(PCR)，检测方法 单核细胞增生李斯特氏菌 (Listeriamono— 李斯特 氏菌 (L．innocua)菌株 、绵羊李斯特 氏 cytogenes，简称单增李斯特 氏菌)，能引起人畜 菌 (L．ivanovii)菌株 、大 肠 埃 希 氏菌 (Es— 共患疾病 ，是食 品卫生上的重要病原菌…。根 cherichiacoli)菌株 、蜡样 芽孢 杆 菌 (Bacillus 据 wHo 的报道 ，乳制 品的污染率为 5％～ cereus)菌株 、鼠伤寒沙 门氏菌 (Salmonellaty— 10％，肉及制 品的污染为 30％，家禽 的污染为 phimurium)菌株 、金黄色葡萄球菌 (Staphylic— 15％，水产品的污染为 4％～8％。该菌主要感 OCCUSaureus)菌株 ，由中国药 品生物制品检定所 染老年人 、小孩和免疫缺 陷个体 ，可导致脑膜 提供 。 炎 、脑炎 、败血症等 ，病死率较高 ，达 25％～ 1．1．2 试 剂 30％l 。近年来 ，一些 国家和地 区爆 发了数起 引物 (上海 生工)，WizardGenomicDNA 由该菌 引起 的食物 中毒。该 菌能在低温下 purificationkit(Promega)，SDS(十二烷基磺酸 (4C)生长_3j，因此在普通冰箱 中该菌仍能繁 钠)(Sigma)，Taq酶 (道普)，dNTPs(Promega)， 殖 ，并可发生交叉污染。随着我国冷藏 、速冻食 PCR缓冲液 (道普)，溴化 乙锭 (Sigma)，分子质 品消费量的迅速增多，食 品中单增李斯特 氏菌 量 Marker(100～600bp)(鼎 国)，0．5xTBE(鼎 的潜在危险性也越来越大 。应用常规方法检验 国)，琼脂糖 (电泳纯)(Blowest)，无水乙醇 (AP) 耗时费力，程序复杂_4j。采用聚合酶链反应 (北京化工厂)，cch(AP)(北京化工厂)，异丙 (PCR)法检测 ，4h内可完成检测过程 ，大大缩 醇 (AP)(北京化工厂)，NaOH(AP)(北京化工 短了检测 时问。PCR检测方法 的技术关键是 厂)，胰蛋 白胨大豆肉汤 (陆桥)，胰酪胨大豆酵 引物设计和引物 的特异性确定 ，研究中，采用了 母浸膏肉汤 (陆桥)，胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂 扩增单增李斯特氏菌毒力相磁编码基因的 5对 (陆桥 )，碱裂 解 液 (0．5mol／L NaOH，2．5％ 引物_6』，并对这些引物进行了特异性研究 。 SDS)。 1．1．3 主要仪器设备 1 材料与方法 冷冻离心机 (5804R、Eppendorf)，核酸与蛋 1．1 材 料 白质分析仪 (DU640型、Beckmancoulter)，Ge— 1．1．1 菌种