畜禽空肠弯曲杆菌cmp基因结构特点与ST型研究.pdfVIP

畜禽空肠弯曲杆菌cmp基因结构特点及ST型研究 匡学谦1 岳华1 陈小飞1，2 汤承1 1.西南民族大学生命科学与技术学院 四川，成都6100412.农标普瑞纳 （成都）饲料有限公司 四川，成都610052 [目的]本实验的目的是对分离自牦牛、猪和鸡的空肠弯曲杆菌(C.jejuni)主外膜蛋白基因 (cmp)结构特点和基因序列型(ST)进行研究。[方法]共克隆分析了60株 （牦牛15株、猪22株和鸡23株）空 肠弯曲杆菌分离株cmp基因的完整编码框，构建进化树，并参照国外文献报道以核苷酸序列中的一个核苷酸不 同，认为是不同的ST型为标准，进行序列分型。结果：结果表明：60条cmp基因的有13个不同的长度，含有7～10个 预测的表面暴露的Loop环和15～20个抗原表位位点，在cmp基因序列中，可变的核苷酸和推导的氨基酸的位置主 要集中于6个高变区，都位于预测表面暴露的环上，共鉴定出46个不同的ST型，另外发现2株 （1株牦牛源和1株猪 源）与结肠弯曲杆菌有重组现象的发生。[结论]国内的cmp基因存在丰富的遗传多样性，ST型结果显示与菌株 的宿主源有一定联系。 空肠弯曲杆菌；cmp基因；结构特点；系统发育分析；ST型 四川省畜牧兽医学会2012年学术年会 的cmp基因序列分型与脉冲场凝胶电泳分型又有较高的吻合性，也有研究表明编码主外膜蛋白的基因是一 个用于大范围分型的宝贵的工具。因此，cmp可作为重要的分子遗传和基因分型的标记，有利于流行病学调 查。 外膜中的主要成分，在细菌同外界环境的交流过程和致病过程中都扮演重要角色，与宿主免疫系统的相互 作用或在细菌的生长环境条件中承受更高的选择压力，一般比管家基因具有更高的变异。目前研究报道 在结构上一个典型的孔蛋白亚基由16—18个B链形成反平行的B桶，小转位于桶的底部，面临着壁膜间隙， 而长的Loop环位于桶体的顶端，面临表面的细菌膜。但国内还未见cmp基因结构特点和分型方法的研究报 分型，旨在研究国内动物源的C．jejuni的cmp基因结构特点和遗传多样性。 1材料与方法 1．1分离菌株、参考菌株及培养基 ATCC33560、E．coil JMl09(西南民族大学动物医学实验室保存)。空肠弯曲菌琼脂基础培养基、LB固体培 养基和LB液体培养基购自杭州微生物试剂有限公司。 1．2主要试剂 新生牛血清(成都哈里生物公司)：DNA回收试剂盒(北京TIANGEN公司)：DNA U／儿)、dNTPs、Pmdl8-T 司)；TaqDNA聚合酶(5 公司)：琼脂糖、蛋白胨和酵母提取物(Oxoid公司)。 1．3主要设备 高速离心机centrifuge5804(Eppendorf公司，德国)：普通PCR仪my universal。。(Bio—Rad公司，美国)：凝胶成像系统VerSa 国)：核酸电泳仪powerpac (ThermoformaUSA)：恒温水浴器(国华电器，中国江苏)：移液器(Eppendorf公司，德国)。 1．4 crop序列的扩增 00 用酚氯仿方法提取细菌的基因组DNA，调整DNA浓度为1ng／uL，作为PcR模板。采用文 献中针对C．jejun uL反应 PCR P1、 buffer 2P-L，lOpmol／I_tL 体系，其中含i0X 2．5儿，2．5mmol／LdNTP2“L，25mmol／LMgCl2 P2各1uL，5U／I_tL 5min：940Clmin、600Clmin、720C u 琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果。按上述条件扩增100 胶回收试剂盒操作说明进行目的片段的纯化回收，回收后再1％琼脂糖凝胶电泳检测。按照纯化产物 4．2uL，PMDl8一TVector0．8uL，SolutionI(连接液)5pL，最后混匀，离心，置于