红曲霉谷氨酸脱羧酶地性质研究.pdfVIP

红曲霉谷氨酸脱羧酶的性质研究 徐冬云江仲文 (轻工业杭州机电设计研究院) [摘要]确定了快速测定红曲衙谷氮酸脱羧酶(GAD)酶活的测定方法一比色法．得到GAD酶活的适宜反应底 5’一磷酸吡哆 物体系为：0．Imol／L的柠檬酸缓冲液，pH5．0，内含50mol／L底物L一谷氨酸钠(L一8SG)、0．Imol／L L酶液于37℃水浴中反应一定时间(根据活力大小反应0．5～20h 醛(PIP)：测定方法为：200pL底物溶液和100p u mL新鲜配制的6％苯酚和 不等)，在冰浴中加入200L、0．2moI／L、pH9．0的硼酸盐缓冲液终止反应，再加入1．0 400uL次氯酸钠溶液并充分振荡．置于沸水浴中反应10min，迅速在冰浴中冷却5min，于630nm下测定吸光值。通 CL-6B凝胶柱层析，对红曲霉GAD进行了有效的分离和纯化，纯化后酶活 过细胞破碎、(NH4)。S04盐析和Sepharose 30℃．在pH4．4～4．8范围内酶活较高．红曲霉培养到第6天时GAD活性达到最高。 关键词： 红曲霉谷氨陵脱羧酶(GAD)比色法 神经系统兴奋性和抑制性神经递质，在神经系统疾病的发病中起重要作用，尤其是谷氨 酸(Glu)和GABA的平衡失调，在某些疾病如癫痫发病中的作用近年来引起了人们的广 泛关注。已知GAD是将Glu脱羧生成GABA的关键酶n3。目前，富含GABA食品的开发受到重 视，成为研究的热点。已经报导有高产GABA的红曲霉，表明其有较高的GAD活性担3。GAD 作为生物技术富集生产GABA的关键酶，其活性测定对深入研究生物代谢活动有重要意 义。同时，GAD在植物中也广泛分布，它的活性高低可指示种子发芽能力和出苗率等。 人体内，研究表NGAD是I型糖尿病人体内主要的自抗原，作为诊断酶来区分预测糖尿病 以及作为极具潜力的诊疗型酶制剂。GAD的生产和纯化逐渐成为一种产业，有很好的市 场前景‘引。 1材料与方法 1．1实验菌种 1 Monascus GM00 pilosus 1．2培养基及培养方法 1．2．1培养基 (1)试管斜面培养基 6 X180cm试管。经0．098MPa灭菌30min，制斜面。 至4．8，加1．8％琼脂，分装18 (2)液体种子培养基 0．1％，KH：PO。0．1％，用乳酸调节 葡萄糖6％，蛋白胨2％，NaNO。0．2％，MgSO。·7H：0 5．0左右。 至pH (3)液体发酵培养基 5．0左右。 0．1％，用乳酸调节至pH MgSO。·7H。0 1．2．2培养方法 试管斜面培养：试管斜面接种后，在30C培养箱中培养5一．-,7d，至菌丝长满斜面。 种子液培养：用5mL无菌水洗下新鲜培养好的试管斜面孢子，接种到装有lOOmL种 子液培养基的500mL三角烧瓶中，在30℃、180r／min的旋转式摇床上培养2d。 产GAD液体摇瓶发酵的培养：将培养好的种子液按10％(v／v)的接种量接种于装有 i．3红曲霉GAD的分离和纯化 1：3．1红曲霉GAD粗酶液的提取 发酵液用纱布过滤后，拧干水分，加入适量的石英砂，在冰浴中研磨约20分钟， 沉淀溶于最少量的标准缓冲液中。标准缓冲液中透析，至无(NH。)：S0．为止，透析液作为 粗酶液，低温下保存备用。 CL-6B,凝胶柱层析 ．／37j2、8epharo_se 选择Sepharose 装入2．4amX120cm的层析柱中，用34倍体积的标准缓冲液平衡。一定量的红曲霉GAD 粗酶液上样后，用标准缓冲液洗脱，分部收集洗脱蛋白。合并含60％以上