DHV-Ⅰ单克隆抗体制备与胶体金试纸条研制.pdf

目 录 1．2．2DI-Ⅳ：-I感染和致病的分子机制………………………………………9 1．3鸭病毒性肝炎病毒(DHV．I)的诊断方法……………………………10 1．3．1根据临床症状初步诊断………………………………………………10 1．3．2根据病理剖检变化诊断………………………………………………11 1．3．3病原学诊断…………………………………………………………11 1．3．4血清学诊断……………………………………………………………12 OOQOO…………………………………………12 1．3．5分子生物学诊断………O 1．4DHVo I的预防与治疗…………………………………………………13 OOOOQ………………………………………………………13 1．4．1预防……O OOOgg…………………14 1．4．2治疗…………………………………………O OQOOO………………………………14 1．5单克隆抗体研究进展……………O Qooog…………………………15 1．6免疫胶体金概述………………………o 1．6．1胶体金技术的基本原理………………………………………………16 1．6．2免疫层析的概念………………………………………………………17 1．6．3免疫胶体金技术的特点………………………………………………17 1．6．4试纸条的检测原理……………………………………………………18 1．7本研究的目的及意义…………………………………………………19 2材料与方法………………………………………………………………21 2．1材料………………………………………………………………………2l 2．1．1菌(毒)株………………………………………………………………21 2．1．2实验动物及细胞株……………………………………………………21 2．1．3酶和相关试剂……………………………………………………2l 2．1．4主要仪器……………………………………………………………21 2．1．5引物设计与合成……………………………………………………22 2．1．6溶液系统……………………………………………………………22 2．2方法………………………………………………………………………22 2．2．1病毒的增殖与纯化……………………………………………………24 2．2．2病毒总RNA提取………………………………………………………25 2．2．3DHV-IVPI目的片段的扩增………………………………………25 6 2．2．4电泳检测……………………………………………………2 2．2．5目的核苷酸克隆测序………………………………………………27 2．2．6重组表达质粒的构建……………………………………………30 2．2．7重组质粒在大肠杆菌中的表达与检测……………………………31 2．2．8Balb／c小鼠的免疫…………………………………………………32 2．2．9间接ELISA检测方法的建立……………………………………33 2．2．10 SP2／O骨髓瘤细胞的培养…………………………………………36 2．2．11饲养细胞的制备……………………………………………………36 n 2．2．24免疫层析试纸条的组装……………………………………………43 2．2．25免疫层析试纸条的性能测试……………………………………43 3结果与分析………………………………………………………………45 3．1鸡胚增殖结果…………………………………………………………45 3．2病毒纯化结果…………………………………………………………45 3．3目的片段的测序结果……………………………………………………45 3．4重组表达质粒的构建和SDS．PAGE结果………………………………46 3．5Western blot分析结果………………