壳聚糖降解酶筛选的研究.pdfVIP

壳聚糖降解酶筛选的研究 郑连美 0027) (浙江大学生物化工系杭州31 摘要本文研究了本实验室培养的纤堆素醇，木霉(Trichoderma，sp)所产壳聚糖醇和混合蛋 白酶对壳聚糖溶液的酶解务件和效果进行综合评骱．结果表明，未霉所产壳聚糖醇时壳聚糖水解 效果较差，混合蛋白酶水解速度最慢，纤雏素酶的综合性能优良，而确定纤维素酶醇解的最佳条 件：播床转速为lOOr!om．pH5．饥温度为50(3，母的加八量为26u，g底袖． 关t词 壳聚糖壳低聚糖 纤堆素酶 篝降解 甲壳素、壳聚糖作为_种生物相容性良好曲新型生物材料，尤其是在生物医学领域有更广 泛的应用前景，人们发现壳聚糖经水解生成的{I聚合度的葡胺糖显示其独特生理活性和功能性 质。具有更魅力的新用途：提高巨噬细胞的功能；促进脾脏抗体生成，具有抗肿瘤和抑制肿瘤 转移的作用。降低胆固醇和血脂}分量，抗血栓、4抗凝血、抗菌、抑茵等生物活性，并能选择性 地活化、增殖人体肠道内的双歧扦菌，特别是较高聚合度的壳低聚糖，具有阻碍病原菌生长繁 殖的功能，促进蛋白质合成，活化植物细胞，从而促进植物快速生长等等。 目前有水解法、酶法和糖转移法3种制备方法获得壳低聚糖。水解法是用盐酸将甲壳质和 壳聚糖部分水解，得到低聚糖溶报，经浓缩法除去剩余盐酸，再用阳离子交换色谱分离获得不 同分子量的壳聚糖，此法对四糖以上的低聚糖收率很低，且酸水解产生大量的D一葡糖胺，使得 分离过程非常复杂，环境污染严重。糖转移法是建立在酶反应的基础上，是利用低聚合度寡糖 在酶作用下，延长糖链成为高聚合度的寡糖。酶降解法是利用甲壳质、壳聚糖降解酶降解壳聚 糖生成低聚糖的一种方法。降解壳聚糖的酶可分为专一性酶和非专一性酶。由于酶解法反应条 件温和，成本低，控制酶解条件订以获得所需的低聚糖产品。但选好降解酶是此法的关键。本 文对不同酶进行考察，评选出最佳的实验室培养的纤维素酶，进行酶解法制备低聚糖研究。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1壳聚糖酶木霉(Trichodernia,sp)发酵提取得到，浙江省农科院。 1．1．2纤维素酶本实验室筛选菌株培养提取，活力：100U／rag。 1．1．3混合蛋白酶中性蛋白酶，无锡酶制剂厂：胰酶，浙江三叶生化厂。 1．2实验方祛 1．2．1酶解法在适当条件下用酶降解壳聚糖，然后经过滤除去变性酶和未水解的壳聚糖，浓 缩滤液，再用柱色谱分离各种低囊糖，对分离所得的各组份进行成分分析，最后，用真空干燥 获得低聚糖产品。 1．2．2样品分析每次取样2．5ml，以稀NaOH调至pH 法测定还原糖含量。 1，2．3液相色谱分析 流动相：超纯水0．5ml／min：柱温：80℃：填充柱：SCLOLL型糖柱； 检测器：示差折光检测器。 2实验结果与讨论 (1)首先对木霉所产壳聚糖酶、纤维素酶和混合蛋白酶，在1％壳聚糖溶液50ml中．摇床转 速为lOOr／min的条件下。对不同pH、温度和加酶量进行正交试验，选取最适宜酶活力存在条件 附近数据进行考察，正交表如表1所示。 寰1正交表 1 4．6 48 15 壳聚糖酶 2 4．8 50 20 纤维素酶 a i雹 堑 ． 踅 堡垒童自堕 试验结果表明，各种酶水解所得最大吸光值之和为：纤维素酶壳聚糖酶，混合蛋白酶这里需说 明：混合蛋白酶加入量为实验设计量的20倍的情况下，效果仍是最差。 (2)考察了纤维素酶、术霉所产壳聚糖酶在相同条件下对壳聚糖的水解情况，按表二分别进 行正交试验。试验结果可以发现规律：酶的加入量对降解速度影响晟大，其次是酶解的温度控 制，500C比460C好，口H在4．6～i0范围内都是适宜的，影响最小。然后对纤维素酶和壳聚糖 酶采用同样反应条件，将各自的最佳酶解效果进行比较。如图l所示。由图l可知，纤维素酶 的酶解效果比壳聚糖酶的酶解效果好得多。 表2纤维囊孽和壳氍耩承解条件谶正交表(搁湃带述lOOr／-in)