含表皮干细胞组织工程皮肤的构建研究.pdfVIP

细胞的浸润．体内永久植入的安全性得以保障． 虽然本实验采用的技术在裸鼠体内得以成功，但还需进一步研究其在免疫活性动物体内的构建 组织工程化睾丸假体的特点，另外。对内支撺材料弹性的优化将更会适应于临床应用的需要． 含表皮干细胞组织工程皮肤的构建研究 胡葵葵戴育成李剑雷英袁敬东李洁吴琼 南昌大学附属第二医院(330006) 摘要目的：用表皮干细胞和成纤维细胞作为种子细胞研制一种增殖能力强的具有表皮，真皮 的组织工程化人工复合皮肤．方法：从幼儿包皮中分离表皮干细胞，用胶原Ⅳ纯化、富集表皮干细 胞，接种在313细胞滋养层上，将体外传代培养的表皮干细胞和真皮成纤维细胞分别接种在经冷冻 干燥及戊二醛交联的I型胶原基质网架的两侧，在液面下培养3周后。改为气．液界面培养，构建含 表皮千细胞的复合皮肤，并进行组织学、免疫组织化学及电镜观察．结果：表皮干细胞呈克隆状生 长，G帕l期细胞和％吨CD71a‘细胞百分率明显高于对照组，差异有统计学意义(阳0．05)，实验组 K19免疫细胞化学染色呈阳性，对照组呈阴性．光镜下观察可见体外培养的含表皮干细胞的人工复 合皮肤。具有表皮和真皮，表皮层由基底至浅层可见3～5层细胞，角蛋白免疫组化染色阳性．结论： 表皮干细胞种植于胶原海绵膜上，可生成全层组织工程皮肤，具备了同正常皮肤类似的结构，表咐 其具有在体外分化成表皮的能力。 目前临床上采用不同分化程度的细胞制备的各种人工复合皮肤基本上解决了大面积深度烧伤后 的创面覆盖问题．但仍存在局部皮肤薄弱、抗拉及抗摩擦能力差等不足，而且在远期随访过程中常 发现表皮丢失，即使是培养的自体移植物亦然。推测其临床效果差的原因可能是移植的细胞为增殖、 分化能力差的较老化细胞。选择何种细胞作为组织工程皮肤的种子细胞成为当前研究的关键。 表皮干细胞是表皮发生、分化和创面修复的摇篮，其正常增殖分化是维持皮肤正常组织结构和 细胞内环境稳定的基本要求，也是皮肤组织工程理想的种子细胞。我们在成功分离、纯化、扩增表 皮干细胞的基础上，构建组织工程复合皮肤．为临床应用奠定基础。 1材料和方法 单克隆抗体(BD)，鼠抗人角蛋白19(K19)单克隆抗体、兔抗人角蛋白多克隆抗体，6一硫酸软骨 素C(Sigma)等． 1．2方法 第2天吸掉未干燥的残留溶液，置37C半小时备用． ～222～ 1．2．2表皮干细胞的分离、富集、培养无菌条件下取包皮环切术后的幼儿包皮，消化后揭下表皮， 置37(2、5％C07、饱和湿度的细胞培养箱，每隔3天换液．倒置相差显徽镜蕊察细胞生长和形态变 化情况．大集落(细胞数大于100)形成后2～3d，即可传代． 1．2．3干细胞鉴定①形态学观察和大集落记数；②细胞传代数；③流式细胞术进行细胞周期分析： 收集实验组和对照组的第3代细胞，各取lxl05细胞周期分析；④流式细胞术进行a6和c岛I鉴定： 单克隆抗体，进行双色荧光标记。上流式细胞仪分析、鉴定：莲)K19免疫细胞化学染色(按试剂盒 说明书)。 1．2．4胶原海绵膜的构建诹大鼠鼠尾肌腱消毒剪碎。用酸提取法提取胶原，将俑【酸软骨素C溶 液加入胶原溶液，于．30(2冰箱预冻4h后，用真空冷冻干燥机进行冻干．然后置于真空高温行初步 交联，再加入O’05％戊二醛进行第二次交联(4℃，24h)，真空干燥后即得胶原海绵膜，行扫描电镜 检查，采用重量法测定其空孔率： 空孔率=【浸润D--Hanks的重量(舻争冻干燥后的重量@】，体积(c矗)xlOO％ 架，收集第2代入表皮干细胞，接种在基质丽架上，密度为2×10s，cm2。培养体系为：无钙低耱DMEM 干细胞基本融合后将其仔细转移到不锈钢网架上，行气一液界面培养，角质形成细胞层上面可以接 触到空气和coz而进一步分化角化，下面能汲取培养体系的营养成分生长．缝续培养12d左右。以 接种未进行粘附的角朊细胞作为对照．倒置显微镜下观察。②组织学观察构建后的复合皮用10％ 福尔马林固定，进行常规脱水、包埋、切片，HE染色，光镜下观察。③角蛋白染色将制备的人工 皮肤行角蛋白(CK，广谱)免疫组化染色(按试剂盒说明书)。 1．2．6统计分析所有数据均表示为均值士标准差。采用SPSS9．0软件进行方差分析及多重比较检 验。 2结果 2．1表皮干细胞的生长与传代未粘附的细胞未见集落生长，而粘附细胞则在第3～4d见多个集落 出现，集落细胞增殖缓慢，第7～8d形成大克隆。在21d左右融合成片．大集落形成后2～3d可传 代，克隆出更多的集落。未粘附细胞传至2～3代即不能生长，