猪伪狂犬病病毒闽A株gE基因的克隆表达及其表达蛋白变性复性地研究.pdfVIP

猪传染病 后镜检，可发现有大量成对、链状或葡萄串状的革兰氏阳性球菌存在，按视野内数量多少依 次为：表皮及结痂、心血、肺脏、肝脏。 3．1．2细菌的分离培养 无菌操作取病料接种于普通营养琼脂平板、高盐甘露醇琼脂平板37。C24h后，菌落直径 约为Imm，光滑、圆润、隆起、白色不透明，若继续培养超过48h后则逐渐有色素产生， 使茵落由最初的白色变为淡橙黄色、黄色或金黄色，此种色素可溶于乙醇，此时菌落直径可 达2—3mm，以接种环轻挑发现略有粘性。高盐甘露醇琼脂由红色变为黄色；该分离菌在 绵羊血琼脂上生长，为较大的白色茵落，37。C30—36h时其直径可达2-3mm，完全溶血带 的外周有一较宽的不完全溶血区，与完全溶血带无明显界限，使其看上去不透明，将该平皿 放到4。C冰箱4h后再观察，不完全溶区变为完全溶血区：在血清肉汤中生长迅速，37℃24h 后使肉汤变混浊，管底有沉淀物，轻摇可散开，随培养时间延长逐渐有黄白色粘稠物沉不管 底。 3．1．3生化特性 能分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇产酸不产气、靛基质试验阴性，MR试验 阳性，VP试验弱阳，分解尿素，可将美兰、石蕊还原为无色，性凝固酶阳性。 3．2家兔接种试验 选择经伪狂犬病酶联免疫吸附试验检测抗体阴性成年家兔4只。无菌采集病猪的脑、扁 桃体、淋巴结，混合后剪碎，用组织匀浆器研磨，用生理盐水配成l：5乳悬液，反复冻融2～ 2 3次后，以3000r／min离心10min，取上清液加青霉素溶液，4℃冰箱中放置lh。取处理好 的组织悬液颈部皮下接种家兔2只，每只2 mL。接种l一2天后注射部位出现奇痒症状， 摩擦接种部位，并不时用爪和嘴撕啃接种部位，致使接种部位出血，皮肤溃烂，并出现尖nq、 抽搐、角弓反张等症状，最后死亡。 4小结与讨论 4．1根据流行病学，临床症状，病理剖检变化、实验室检查及家兔接种等试验结果确诊 为猪伪狂犬病、金黄色葡萄球菌性皮炎混合感染。 4．2该场种公、母猪没做伪狂犬疫苗，所以在哺乳期和断奶期的仔猪抗体水平比较低， 由于伪狂犬病病原侵入引起全群暴发，发病仔猪抵抗力下降造成金黄色葡萄球菌感染。 4．3对本病的防制应采取综合防治措施，种猪要进行疫苗免疫，疫情严重时仔猪也要进 行疫苗免疫，建立健全的免疫监测制度，定期进行抗体监测，以便根据抗体监测结果，及时 进行适时免疫和采取其它的相应措施，防止疫病的发生。 4．4规模化养猪场必须建立健全的兽医卫生防疫制度。在预防接种的同时，一定要结合 搞好环境卫生、严格消毒、药物预防等综合防治措施，才能避免疫病的发生。 猪伪狂犬病病毒闽A株gE基因的克隆表达及其 表达蛋白变性复性的研究 樊淑华1李文刚2昊凤笋1 项朝荣l韩勇l卢中华1 (1．河南农业大学郑州4500022．郑州牧业工程高等专科学校郑州450011) 摘要：根据伪狂犬病病毒MinA株gE基因序列，设计合成l对引物，采用PCR方法，从伪狂犬病病毒闽A 株基因组DNA扩增出630bp的片段。将该片段克隆到pOEM．T载体中，测序正确后再将其克隆到表达质 鉴定分析，融合表达产物大小约29KD，蛋白薄层扫描分析表明，该蛋白约占菌体总蛋白的30％．对原核中 以包涵体形式高效表达的伪狂犬病病毒gE蛋白抗原表位区段进行了变性、复性的研究，建立了变性、 复性的方法，获得了可溶性的具有生物学活性的蛋白质，为gE蛋白作为基因工程抗原的进一步应用打 下基础。 关键词：伪狂犬病病毒闽A株；gE基因；大肠杆菌；基因表达；变性；复性 ．．220．． 第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会2006年会议论文集 入神经系统方面被认为比其它单个非必需糖蛋白缺失苗更安全，同时gE不会影响病毒的复 制和中和抗体的产生，并且gE是所有野毒株均能表达的～类糖蛋白[1】。因此gE可作为标 志基因，区别感染动物和接种动物，为剔除阳性的野毒感染动物，根除本病提供良好的前景。在 大多数已启动伪狂犬病根除计划的国家，以gE．ELISA的鉴别诊断应用最为广泛。但所采用的 抗原主要来源于细胞培养物或杆状病毒表达产物，成本较高[2～3】。大肠杆菌表达产物虽然缺