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负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定_医学论文 负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定_医学论文 作者：陈陵，向国春，李向红，蔡永国，李晶晶，房殿春，罗元辉，李志宏，杨仕明 【关键词】 腺病毒表达载体 Package and identification of replicationdeficient recombinant adenovirus expression vector of hTERT 　　【Abstract】 AIM: To construct a replicationdeficient recombinant adenovirus expression vector of hTERT (AdhTERT). METHODS: The hTERT gene was cloned at the downstream of CMV promoter of the adenoviral shuttle plasmid pDC315 in sense direction and the resultant recombinant plasmid pDC315hTERT was cotransfected into HEK 293 cells together with plasmid pBHGlox (deltaE1, 3) containing adenoviral genome. The adenovirus expression vector was then obtained and identified by infection test, electron microscopic observation and PCR coamplification. RESULTS: After purification and concintration, the titer of AdhTERT reached 5×1012 pfu/L. Virus particles could be found in HEK 293 cells under transmission electron microscope. Both adenovirus and hTERT special fragments could be amplified from AdhTERT by PCR, whereas hTERT special fragment could not be amplified from the control. CONCLUSION: The replicationdeficient recombinant adenovirus expression vector of hTERT is successfully constructed. 　　【Keywords】 human telomerase reverse transcriptase adenovirus expression vector 　　【摘要】 目的: 构建负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的复制缺陷型腺病毒.方法: 将克隆有正义hTERT cDNA的腺病毒穿梭质粒pDC315hTERT与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK 293), 包装负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒表达载体（AdhTERT）. 对AdhTERT扩增、纯化并浓缩后，进一步行感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定. 结果: 纯化浓缩后的AdhTERT滴度可达5×1012 pfu/L. 电镜下可见在HEK 293细胞中形成的病毒颗粒，PCR双引物鉴定AdhTERT可扩增出Ad及hTERT特异片段，而对照则不能扩出hTERT片段. 结论: 成功构建了负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒. 　　【关键词】 人端粒酶逆转录酶；腺病毒表达载体 　　0引言 　　人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT) Mr 127 000，包含1132个氨基酸，其基因位于5号染色体短臂的最末端（5p15.33），在90%以上的人类肿瘤中高表达，而正常成熟组织中则基本没有表达［1］，因而hTERT是一很有前景的广谱、特异的抗肿瘤治疗靶点. 腺病毒载体系统具有宿主范围广、感染率高、包装容量大、繁殖滴度高、不发生整合及安全性好、性质稳定、载体制备较容易等特点, 目前已成为继逆转录病毒载体后被广泛应用的载体系统［2］，可用作hTERT的异位表达工具. 我们通过构建hTERT腺病毒表达载体，为进一步研究以hTERT为靶点的肿瘤免疫治疗奠定基础. 　　1材料和方法 　　1.1材料