香豆雌酚对新生大鼠成骨细胞增殖分化的影响_医学论文.docVIP

香豆雌酚对新生大鼠成骨细胞增殖分化的影响_医学论文 香豆雌酚对新生大鼠成骨细胞增殖分化的影响_医学论文 作者：韦继南,吴小涛,陈晓刚,王斌 【摘要】 目的：观察香豆雌酚对大鼠成骨细胞(OBs)增殖分化的影响，初步探讨香豆雌酚对OBs的作用机制。方法：用不同浓度香豆雌酚干预OBs，根据不同时间分别用酶消化法测碱性磷酸酶活性和羟脯氨酸含量、放免法测骨钙素含量及半定量RT法检测OBs内OPG/RANKL基因的表达。 结果:香豆雌酚呈浓度和时间依赖性促进大鼠OBs增殖及碱性磷酸酶表达干预12h，各浓度组羟脯氨酸含量呈浓度依赖性增高，其中10-8mol·L-1作用最大(P=0.022)；培养12h，OBs表达骨钙素呈浓度依赖性，24h达高峰，其中10-8mol·L-1有显著性差异(P=0.012)，48h有所下降；不同浓度、时间组香豆雌酚均能促使OBs增加表达OPG mRNA，同时有抑制RANKL mRNA表达的作用，其在24h 10-8mol·L-1浓度作用强度最大(P=0.038)，10-5mol·L-1则呈现抑制作用。结论:香豆雌酚能促进OBs的增殖分化，其作用呈浓度和时间依赖性，且至少部分有OPG/RANKL途径的参与。 【关键词】 香豆雌酚；成骨细胞；护骨素；骨质疏松；大鼠 雌激素在绝经后骨质疏松的发生发展中起着十分重要的作用，绝经后雌激素替代疗法(hormone replacement therapy,HRT)曾被认为是绝经后骨质疏松治疗的金标准，但随着HRT所带来的阴道出血、乳腺癌、子宫内膜癌等风险大大限制了其临床推广应用[1]。近年来植物雌激素(phytoestrogen,PE)备受关注，它们的结构类似于17β雌二醇，能预防和治疗绝经后骨质疏松，但对子宫和乳腺无刺激作用[2]。动物实验表明，PE香豆雌酚能减少去卵巢大鼠骨丢失和骨吸收，增加骨密度[3],有研究报道香豆雌酚能抑制RANKL诱导的破骨细胞分化成熟及骨吸收活性[4]，但其具体机制尚不清楚，对成骨细胞的作用也未见报道。为观察香豆雌酚对成骨细胞的直接作用，本实验拟用香豆雌酚干预体外培养的新生大鼠成骨细胞，观察其对成骨指标的影响，初步探讨其对骨代谢的作用及其机制。 　　1 材料和方法 　　1.1 主要材料新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供）,LG杭州四季青),ALP染色试剂盒(南京建成生物研究所),骨钙素试剂盒(北京科美东雅公司),TRIzol(Katara Ltd.),RT型胶原酶、胰酶、MTT、DMSO、Coumestrol、Estradiol(Sigma Ltd.USA),其余试剂均为国产分析纯。 　　1.2 细胞培养 1.2.1 新生大鼠颅骨成骨细胞培养 参照文献[5]将新生lt24h的SD大鼠放入75%酒精中浸泡5min,无菌取出颅盖骨，清除血管结缔组织,PBS洗涤。将颅盖骨剪成1mm3大小,0.25％胰蛋白酶37℃消化30min,弃去消化液,加入5ml 0.1%Ⅰ型胶原酶消化60min,以200目筛网滤去骨渣，滤液1000 r·min-1离心10min，弃上清，加入含10% FBS的DMEM培养液并调整细胞密度，按1×105ml-1接种细胞于一次性无菌培养瓶中,置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。 1.2.2 成骨细胞鉴定 1.2.2.1 形态学观察 细胞培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况，药物干预前行台盼蓝染色观察细胞存活率。 1.2.2.2 碱性磷酸酶染色(改良Kaplow法) 细胞消化后将5mm×5mm大小无菌盖玻片置于培养瓶中，细胞贴壁后取出盖玻片，按试剂盒说明书进行碱性磷酸酶染色。 　　1.3 观察指标 1.3.1 MTT 细胞传代后按2.5×104ml-1接种于96 孔板，2d后改为无血清培养液，24h后分别换为含0 mol·L-1，10-10 ~10-5 mol·L-1香豆雌酚的培养液,并设阳性对照组Estradiol (10-8 mol·L-1),每种浓度重复７孔。在加药后12、24和48h分别取出1块培养板,每孔加入20μl MTT(5 mg·ml-1)37℃继续培养4h，弃培养液,每孔加入200μl DMSO，5min后在酶标仪上490nm波长处测各孔吸光度值,结果用A490 nm表示。 1.3.2 碱性磷酸酶 细胞接种于6孔板，分组同上，干预12、24和48h后弃培养液，PBS清洗2次，每孔加入1ml 0.1％TritonX，反复吹打后1000r·min-1离心3min，酶消化法测上清液中碱性磷酸酶的含量。 1.3.3 羟脯氨酸 细胞接种于6孔板，分组同上，干预12、24和48h后用酶消化法测上清液中羟脯氨酸的含量(委托南京建成生物研究所检测)。 1.3.4骨钙素 细胞接种于6孔板