骨组织形态计量学在骨折愈合实验研究中的应用_医学论文.docVIP

骨组织形态计量学在骨折愈合实验研究中的应用_医学论文 骨组织形态计量学在骨折愈合实验研究中的应用_医学论文 摘 要：骨组织形态计量学是对骨组织进行定量描述的一门技术。目前用于骨质疏松的研究较多，但用于骨折愈合的研究不多。回顾了该方法在骨折愈合实验研究中的主要技术步骤及我们的经验，并对相关参数做了详细描述。 关键词：骨组织形态计量学；骨折愈合；实验研究 1 引言 骨组织形态计量学（Bone histomorphometry），是对骨组织进行定量描述的一门技术，目前主要通过对显微镜下骨组织二维平面的测量，根据体视学原理，推测或转换获得三维参数〔1〕。其基本原理为Cavalieri原理和Delesse原理。Cavalieri原理由17世纪意大利数学家Cavalieri提出，其含义是将物体等距做数个切面，各切面的面积之和（∑a）与切面之间距离（d）的乘积，即可求得物体的绝对体积，用公式表示为：V=∑a#12539d。Delesse原理由19世纪法国地质学家Delesse提出，是最基本、最简单、最实用的原理之一，用它可求得面积分数（面积密度AA）和体积分数（体积密度VV），用公式表示为：AA=∑A/∑AO=VV（∑A为切面内特征物面积之和，∑AO为切面内参照面积之和）。体视学在材料学、地质学中开展较早，称“定量金相”。1968年，国际体视学会成立，开始并迅速普遍用于生物医学领域。通过1973年3月（加拿大）、1976年3月（法国）、1980年3月（美国）3次骨组织测量学国际学术会的召开，为该方法在骨科领域的应用打下了基础〔2〕。1988年，中国体视学学会和中国生物医学体视学会正式成立，体视学的方法开始在国内得到推广和应用。因此，骨组织计量学用于骨科在国内仅10余年时间。目前应用最多的是用于骨质疏松的研究，而在骨折愈合中则较少，二者尽管有许多相同的地方，却也存在明显不同，对此尚需进一步探讨。 2 主要技术步骤 根据我们的经验，其主要技术步骤为标本制备→采图→测量→转换为参数→结论。 2．1 标本制备 实验动物选家兔比大鼠好，因其更易制作硬切片。涉及到四环素标记、取材、固定、脱水、包埋、制片、染色等步骤。 2.1.1 四环素标记 若要获得动态参数，需对动物行四环素族药物活体标记，如四环素、土霉素、金霉素口服或肌注均可，目的是了解骨矿化动态过程。进行双标时为获得可靠标记结果，每次标记最好连续2天，末次标记在取材前2～3天，2次标记间隔时间兔以6天为最佳。如第4、5天行第一次标记，则第11、12天行第二次标记。 2.1.2 取材 一般在兔桡骨中段造成3 mm宽缺损后，以该处为中心共取2 cm长桡骨标本。动作要轻柔，以防再次骨折影响结果的准确性。 2.1.3 固定 一般采用10 %的福尔马林缓冲液（pH 7.0～7.1）或70 %乙醇或100 %乙醇固定3天。对于四环素标记的标本以乙醇固定为好，福尔马林溶液可使标记的颜色减退。 2.1.4 脱水 用酒精从低浓度到高浓度梯度脱水，若采用80 %的固定浓度则勿需脱水。 2.1.5 包埋 包埋剂一般用甲基丙烯酸甲酯和邻苯二甲酸二丁酯，临用时以3 ∶1比例混合，加过氧化苯甲酯适量，可起催化作用。包埋过程中注意负压抽气，防止气泡形成。 2.1.6 制片 传统对骨组织形态结构的观察，一般多用硬骨磨片和脱钙后切片。这些方法各有其不如人意之处，如：硬骨磨片易破裂、不完整；脱钙后切片易变形、失真，使骨组织很重要的成分矿物质丢失。目前，在骨组织的形态计量学研究中，学者们都认为采用锯片后磨片和不脱钙切片较为理想〔3〕。但我们认为，锯片后磨片费时、费力，过程复杂，一般研究人员难以掌握，其片子厚度也较厚，约为20～30 μm，由于投影过多、投影过少、截尾效应将影响部分数据的观察；而采用JungK、LEICA SM等重型切骨机行不脱钙切片，根据需要，可准确获得不同厚度的切片（5～10 μm），简捷、省时、准确。 2.1.7 染色 染色方法需根据测量目的而选择，如Toluidine blue（甲苯胺蓝），可清晰地显示矿化骨小梁、类骨质、成骨细胞、破骨细胞；Masson染色可清晰区分类骨质、矿化骨小梁，但不易区分细胞；H．E染色可区分细胞，但不如甲苯胺蓝清晰。其他〔4〕尚有Von Kossa氏法、Solochro me CyaninR、Goldnen’s Trichrome等，还有像改良的Giemsa、PAS、AB-PAS等。每一种染色方法，无论单一的还是复合的，都使各种组织成分有特定的着色，以便于镜下精确地辨认。 2．2 采图 现在一般都采用一套将显微摄像与计算机相连的特殊图像采集系统（如Nikon Spot图像采集系统）采图。采图需注意样本的代表性与可比性。应遵循等距随机抽样的原则