荧光RT-PCR检测活禽与禽组织中禽流感病毒的研究.pdfVIP

晰囝 2004学术年会 荧光RT—PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究 张鹤晓1，赖平安1，刘环1刘继红1，郭晋优1，谷强1张利峰1，汪琳1段生涛1，张向东 朱文斯2，杨伟2，李宁3 1北京出入境检验检疫局，北京100029；2深圳匹基公司；3中国农业大学 摘要：本研究根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列，开发、设计多条引物和探针序列，从 中筛选敏感、特异的引物、探针，在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上，建 立了快速的通用型“一步法”检测活禽或禽产品中所有A型禽流感病毒的荧光RT，PCR检测技术。该 方法与国际标准方法一一世界动物卫生组织OIE确定的鸡胚病毒分离相比，敏感性基本一致，可直 接用来检测咽喉，泄殖腔拭子和禽肉中的禽流感病毒，将检测时问从原来最短所需要的几周缩短为4 小时。最后，通过运用建立的该方法对国家质检总局组织的盲样测试和在哈兽研进行的临床验证试 验，以及对2120份临床样品的检测，检验证明了该试剂盒优良的检测效果和稳定性。 关键词：荧光RT-PCR；禽流感；禽流感病毒 1前言 禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和戚疾病综合征。高致病力禽流感遥常是由 H5和H7亚型引起的，是严重危害养禽业的重大传染病之一。国际兽医局(OIE)将其列为A类传 染病，我国也将其列为一类检疫对象。 国内外检测禽肉中禽流感病毒常用的方法是鸡胚病毒分离，该方法是OIE推荐的方法，但是耗 费时间长，约需3周左右，不适应我国进出口禽肉快速检验通关放行的需要，也不适应我国加入 WTO后国内消费者对禽肉安全性的需求。荧光RT-PCR技术是将荧光素标记的探针与引物一起，在 荧光PCR仪中反应，电脑对整个反应进行实时监测，避免了交叉污染，大大提高了检测的敏感性， 本研究的目的是：根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列．开发、设计多条引物和探针序列，从 中筛选敏感、特异的引物、探针，建立快速的通用型～步法”检测活禽或禽产品中所有A型禽流感 病毒的荧光RT。PCR检测技术。 2材料与方法 2．1材料 2．1．1病毒株：禽流感病毒六株和三株禽流感病毒H9亚型，均为本实验室从某发病鸡群或鸭群中 分离。 2．1．2病料：某发病鸡场和发病鸭场的病鸡和病鸭各10只，分别取咽喉拭子和泄殖腔拭子及其心、 肝、脾、肺、肾、小肠、腿肌、胸肌、胰腺等。将采集的病料冻存于一80C冰柜中备用。 试剂盒与鸡胚病毒分离试验同时检测。 2．1．4临床验证试验样品：由啥尔滨兽医研究所禽流感重点实验室对三个批次的禽流感通用型荧光 PCR检测试剂盒进行临床验证实验。共检测120多份含有多种禽流感病毒亚型的阴阳性盲样。 2．1．5区域试验样品：课题组对多个禽类养殖场和其他单位送检的2120份检测样品进行检测。 2．1．6主要试剂耗材Taq 酶为Amersham Roche公司产品，SPF鸡胚购自北京实 PharmaciaBiotechInc产品，LightCycler 验动物中心。 2004学术年会 囝嘶 2_2方法 2．2．1靶区域的选择以及引物和探针的设计试剂盒选择禽流感病毒相应的区域作为靶区域。分多 个区段选择其中缺乏二级结构且保守的基因区设计多对引物和探针。 2．2．2荧光RT-PCR反应体系的优化 引物和探针浓度的优化、镁离子浓度的优化、Taq 优化。 2．2．3荧光RT-PCR循环参数的优化、检样病毒核酸提取方法的优化、逆转录条件的优化 2．2．4敏感性试验 日龄鸡胚，每个稀释度接种5枚，每天观察2次。 2．2．5特异性试验 用禽流感病毒通用型荧光RT—PCR检测收集到的常见禽类病毒：新城疫F48E9、新城疫I系苗、 肝炎病毒。 2．2．6咽喉拭子和泄殖腔拭子的采集 从某发病鸡场和发病鸭场分别取10只病鸡和病鸭，采集咽喉拭子和泄殖腔拭子。 2．2．7病料采集 将病鸡和病鸭处死，将采集的病料冻存于．80。C冰柜中备用。 2．2．8样品处理 2．2．8．1组织脏器处理 分别称取29死亡肉鸡或鸭的各种病料，捣碎加入10mLPBS(内含双抗)，3