紫花苜蓿光敏色素B基因片段克隆及RNA干扰表达载体的构建.pdfVIP

紫花苜蓿光敏色素B基因片段克隆及RNA干扰 表达载体的构建 朱见明，王成章，严学兵，樊文娜，杜红旗 河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002 摘 要：根据紫花苜蓿2级标准品种VernalP郴基因的序列 GenBank登录号为 Easy载体上 通过RT-PCR法扩增得到PhyB基因正向、反向目的片段，将片段连接到pGEM．-T 为基础。通过多次酶切和连接，成功地构建了紫花苜蓿PhyB的RNAi表达载体。为进一步研究光 敏色素B与苜蓿秋眠性之间的关系奠定基础。 关键词：紫花苜蓿；秋眠性；光受体；光敏色素；RNA干扰 苜蓿秋眠性 falldormancy,FD 是苜蓿在秋季冈日照长度变短和气温下降时所表现出的一种 适应性生长特性【1】’是栽培苜蓿选择品种时考虑的首要指标【21。从本质上讲，秋眠性是对日照长 度的反应【31，短日照是其主要的影响因子【41。苜蓿作为长日照植物，晚春及夏季长日照条件下有 利于其生长发育，秋冬季短日照则休眠，说明苜蓿秋眠存在着光周期效应15J。光敏色素 photoreceptor 的活动来完成的【副，其参与调控植物的许多生理过程如种子萌发、幼苗去黄化、昼 夜节律及根、茎、叶、花等器官的分化与发刮71。双子叶植物中至少存在尸蜘、PhyB、PhyC、 PhyD和PhyE等不同的光敏色素基因，其中PhyB主要存在于绿色植物中，在光下和暗中都可进 以及植物茎的生长有抑制作用，并且与延迟开花有关，说明PhyB无论在幼苗的生长抑制还是成 株的开花抑制中均发挥了重要作用。PhyB调控的这些生理活动似乎与苜蓿的秋眠性密切相关。 王成章等112】研究了3个不同秋眠型苜蓿在光照为8、12和16 h的光周期条件下叶片和顶芽中PhyB 的含量，结果表明，和非秋眠苜蓿相比，秋眠苜蓿叶片中PhyB含量高，推测PhyB作为绿色植 物主要光受体可能通过光周期调控或参与了苜蓿的秋眠。 自本世纪20年代苜蓿的秋眠性被发现以来，对其调控机理进行了大量研列D。引。由于苜蓿 的秋眠性和抗寒性存在着显著的正相关关系，故多年来科学家们有关苜蓿秋眠机理的研究多集中 在与抗寒性有关的物质代谢上114l，甚至许多人把秋眠性和抗寒性相混淆。近年来的研究表明，苜 蓿的秋眠性和抗寒性为两个独立的性状I临171，短日照和低温分别是苜蓿秋眠性和抗寒性的主要影 响因子，故研究绿色植物主要光受体——砷 ，8在苜蓿秋眠中的作用与功能可能从根本上揭示苜 蓿秋眠性的调控机理。 近年来，RNA干扰 RNA 一性的特点，逐渐成为植物基因功能研究的重要的反向遗传学手段。该技术主要是通过双链 strands RNA doubleRNA。dsRNA 的介导，特异性地降解相应序列的靶mRNA，从而阻断相应的 基因表达，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默 post-transcriptional gene 载体中连入的具有反向重复基因序列片段的结构在植物体内转录为mRNA后，通过自我互补形 成发夹式RNA hairpin 特定基因的表达。研究PhyB基因在苜蓿秋眠性中的作用和功能，RNAi技术是一种理想方法。 本研究根据RNA干扰基因表达的技术原理，以PhyB为靶基因，构建了紫花苜蓿PhyB基因 进一步研究PhyB基因的功能以及探讨PhyB基因与苜蓿秋眠性之间的关系奠定物质基础。 1材料与方法 1．1试验材料 1．1．1植物材料采用秋眠级2级的紫花苜蓿标准品种——vemal，采集实验室盆栽的紫花苜蓿 的幼嫩叶片作为总RNA提取材料。 1．1．2 cold 菌种及载体大肠杆菌 EscherichiaDH．5a转化菌株购白天根生化科技有限公司。 连接载体pGEM@．T 载体pART27i22】由中国科学院武汉植物园黄文俊博士惠赠。 RNAiso 1．1．3主要试剂 Plus TotalRNA提取试剂 、TaKaRaBcaBESTTMRNAPCRKit GelDNAPurificationKit DNA Ver．2．0、DNAMarker、T4 Ver．1．1、TaKaRaAgarose Ligase、各种限 MiniPlasmid 制性内切酶等为宝生物工程 大连 有限公司产品。TIANprep Kit质粒小提试剂盒为 天根生化科技 北京 有限公司产品。试验所用的培养基为LB培养基 10 g胰蛋白胨，5g酵母 提取物，10NaCI定容至l7．0，固体培养基加15％琼脂粉 。其他生化试剂和常规试剂均 g L，pH 为超纯或分析纯级。 1．2引物设计及合成 根据本实验室克隆的紫花苜蓿2级标准品种Vernal accession 表1 。引入的4个酶切位点只在pHANNIBAL的多克隆位点存在，而在所要