应用PCR法鉴定布鲁氏菌种型的方法研究.pdfVIP

应用PCR法鉴定布鲁氏菌种型的方法研究 易新萍1 叶锋1 刘丽娅1 李博h2 吴冬玲3 谷文喜1 吐尔洪江．努尔1 ，钟旗¨ (1．新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐830000； 2．新疆农业大学，新疆鸟鲁木齐830052； 3．新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆乌鲁木齐830000) 摘要 也可以通过多种途径感染人，是典型的人兽共患病。根据国家标准规定，我国主要采用病原学和血清学 方法对布鲁氏茵病进行诊断，但这些传统方法存在着检测时间长、操作步骤繁琐、假阳性和假阴性率较 高、并对实验人员的健康安全构成一定的威胁。随着分子生物学技术的发展，基因诊断在临床中的应用 定布鲁氏茵方法的准确度与可靠性。 关键词 布鲁氏茵；鉴定；PCR 的出现，提高了PCR法鉴定布鲁氏菌的准确度与 布鲁氏菌(Brucella)是布鲁氏菌病(简称布 病)的病原体能感染多种动物引起动物布鲁氏菌 可靠性，为布病的流行病学调查提供了科学的检 病，也可以通过多种途径感染人，造成人布鲁氏菌 测与鉴定方法。 病，是典型的人兽共患病[I]。传统上根据培养、代 1材料和方法 谢抗原特性和宿主特异性，该菌分为7个种(牛 种、羊种、绵羊附睾种、猪种、犬种、沙林鼠种、海洋 1．1菌株与试剂 种)19个型。 标准菌株：B．abortus 布病的诊断中主要采用有病原学和血清学方 16M、B．suis1330、B．ovis63购自中国兽医药品监 法，但这些传统方法存在着检测时间长、操作步骤 察所；S19、S2、M5均由中国动物卫生与流行病学 繁琐、假阳性和假阴性较高、并对实验人员的健康 70202)由中国药品 中心提供；A19疫苗株(CVCC 544A、B． 安全构成一定的威胁。随着分子生物学技术的发 监测所制备、鉴定和供应；B．abortus 展，基因诊断在临床中的应用变的日趋广泛。目 abortus$85A(牛III型)、Rev1及布鲁氏菌B．SU- 前，PCR方法对布鲁氏菌的实验鉴定多以种鉴定 为主[2]。本研究根据布鲁氏菌不同种型DNA的 多态性，将布鲁氏菌virB一8基因[3-‘]与AMOS (Abortus MelitensisOvis Suis)种鉴别方法[5叫]、vis)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏杆菌sg B1牛种I型鉴别方法及单链构象多态分析(SS-一12均由新疆畜牧科学院兽医所保存。 CP)相结合[8--9]，综合应用于布鲁氏菌属、种、型的试剂：Taq 鉴定。为进一步提高传统PCR方法的准确度与 量标准PCR 可靠性而建立了内参PCR法。该方法有效地避 物公司；细菌、组织基因DNA抽提试剂盒 Tissue 免检测过程中人为操作错误，降低了假阴性结果 (DNeasy 反应引物南北京赛百盛公司合成。TS培养基 分布规律，针对保守区域分别设计VirB8、AMOS、 (Trypticsoybroth，胰蛋白大豆肉汤)南Becton andDickinson 2308 company公司生产。 Ery基因序列多AGG三个碱基，分别设计 1．2引物设计与合成 Ery上下游引物，引物南上海生工生物工程有限公 用DNAStar软件分析GenBank中明确分种、司合成，见表1。 型的Brucella基因序列，