荧光定量PCR方法对禽传染性支气管炎病毒感染SPF鸡后在体内分布的检测.pdfVIP

第三篇疾病防治 鹇、斑头雁等产生H5亚型禽流感HI抗体水平较好，而白冠长尾雉、黄鸭、鸳鸯等产生抗体较差；孔雀、原 鸡、白鹇、斑头雁等产生H9亚型禽流感HI抗体水平较高，而白冠长尾雉、鸳鸯、鹦鹉等产生抗体较差。试 验过程中我们还发现一些有趣的现象，东方白鹳不同个体对禽流感(H5+H9)二灭活苗的不同亚型抗原 的免疫反应差别较大，免疫的三只东方白鹳中有两只产生了H5亚型禽流感HI抗体和H9亚型禽流感HI 抗体，可是有一只却只是产生了H9亚型禽流感HI抗体；两只鹦鹉也是对禽流感(H5+H9)二价灭活苗的 不同亚型抗原的反应性差别很大，两只鹦鹉没有产生H5亚型禽流感HI抗体，却能产生较好的H9亚型禽 流感HI抗体。出现这种现象的原因还有待进一步研究。 3．4免疫抗体检测结果表明，虽然珍禽群体的平均抗体水平很理想，但品种间个体差异较大，离散度高， 依然存在感染发病的风险。因此，对抗体水平低或无抗体的珍禽，应及时进行加强免疫，并定期监测抗体 水平。 荧光定量PCR方法对禽传染性支气管炎病毒 感染SPF鸡后在体内分布的检测术 樊汶樵 王红宁 郭自成 管中斌 张 毅徐昌文 杨 帆 (四川大学生命科学学院，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，生物资源与生态环境教育部重点实验室， “985工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平台四川，成都610064) 摘要 目的：检测禽传染性支气管炎病毒(IBV)急性感染SPF鸡后病毒在体内的分布。方法：本研 究建立了使用GAPDH和UB作为内参的禽传染性支气管炎荧光定量PCR方法(real—timePCR)；用IBV标 脏、肺脏、肾脏、胰腺、腺胃、肌胃、盲肠扁桃体和法氏囊的病毒载量，对急性感染后的体内复制动态和分布 情况进行研究。结果：从感染后第4天起，12种组织、器官内的IBV相对含量逐渐升高；15天后开始减 少。肺脏的相对病毒含量最高且可从第4天持续到28天，气管从攻毒后第4天起就能检测到大量的病毒， 一直可持续到35天。肾脏、肝脏和胰腺也具有较大的感染密度。 ‘ 关键词IBV；荧光定量PCR；动态分布；组织嗜性 Infectious Bronchitis 禽传染性支气管炎(Avian Virus，IBV)iJI起的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病，是危害养禽业重要的传染病之一，呈世 界性分布，发生于所有养鸡的国家和地区。 ·基金项目：国家“863”计划项目(2006AAl0A205)，现代农业产业技术体系建设专项资金资助 通讯作者：王红宁(1963一)，女，教授、博士、博士生导师，从事动物疫病防控与食品安全研究。whongning@163．toni 四川省畜牧兽医学会2010年学术年会 IBV血清型众多，致病性复杂，不同血清型之问抗原性差异较大，而且变异明显。传统的检测方法耗 时费力，难以标准化和大规模推广应用。随着生命科学和基础科学的迅猛发展，血清学、分子杂交及聚合 酶链式反应(PCR)等方法、技术逐步应用到检测和鉴定工作中，这些方法特异性好、灵敏度高、耗时短，能 够很好地提高检测效率；但是容易出现假阳性或假阴性结果。实时荧光定量PCR技术(reM—timePCR)检 测的灵敏度比常规PCR高约100倍；不需进行病毒的分离培养，能够进一步简化检测步骤，提高检测效率 和准确性，也能够避免PCR的后续处理所造成的污染。国外学者在2003年开始分别使用染料法和探针 法设计了针对IBV的实时荧光定量PCR方法，均表现出了异于其他检测方法的优越性。 量分析，旨在揭示该毒株在宿主体内复制的动态分布情况和组织嗜性规律。 1材料和方法 1．1引物设计与合成 Premier 根据GenBank中已登陆的序列，利用Primer5．0软件分别设计了IBVM41株、内参基因 (UB)等六对引物(见表1)j引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。 表l病毒与内参基因的引物设计 1．2病毒和SPF鸡 禽传染性支气管炎病毒M41标准毒株购自中国兽药监察所，新城疫病毒(NDV)由本实验室分离保 品疫苗株传代后保存