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基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱与电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱分析蛋白质_临床医学论文 基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱与电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱分析蛋白质_临床医学论文 作者：倪国新 朱镭 马小土 徐学敏 胡晓芳 刘建华 李伟 【摘要】 为比较基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI和电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱(ESI在蛋白质定性和定量分析方面的性能，分别利用两种仪器对用于相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)标记的雌激素刺激前后MCF7细胞内的蛋白质水解产生的多肽进行了定性和定量分析。结果表明，用MALDIF和ESI方法分别鉴定出1086种和848种蛋白质，其中相同的蛋白质为633种;MALDI和ESI方法分别找到38种和33种表达差异在0.5倍以上的蛋白质，其中3种为相同的蛋白质。实验数据说明，两种仪器在蛋白质定性和定量分析方面有很大的互补性，将两种仪器结合使用，不仅能够显著提高蛋白质定性和定量分析的覆盖率，而且可提高分析的置信度。 【关键词】 等量异位标签， 基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱， 电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱， 定性分析， 定量分析 　　1 引 言 　　基质辅助的激光解析电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)是目前用于多肽和蛋白质电离的两种主要方法。这两种方法在多肽离子化方面具有很大的互补性[1]。研究表明，MALDI 有利于碱性氨基酸残基的离子化[2]，ESI 有利于疏水氨基酸残基的离子化[3]。ESI源由于可与液相色谱分离的洗脱物在线连接，因此已成为蛋白质组学分析中广泛采用的离子化方式。但这种分析流程受到质谱分析的循环时间限制。近年来，LC技术的推广显著扩展了MALDI在高通量蛋白质组学研究中的应用范围。由于多肽洗脱峰是离线收集的，因此不受质谱分析循环时间的限制。现阶段蛋白质组学定性和定量研究主要采用“鸟枪法”(Shotgun)进行，保证定性和定量的特异性的同时提高蛋白质鉴定的覆盖率，是一个迫切需要解决的问题。 　　定量蛋白质组学是功能蛋白质组学研究的重要组成部分。稳定性同位素标记结合在线或离线的液相色谱(LC)串联质谱(MS/MS)分析是目前定量蛋白质组学研究所采用的主要技术路线之一。常见的稳定性同位素标记方法包括SILAC(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture)体内代谢标记[4]、ICAT(Isotope、iTRAQ(Isobaric tags for relative and absolute quantification)[6]、体外化学标记及18O稳定性同位素标记[7，8]。SILAC只适合细胞培养条件下进行氨基酸掺入标记，ICAT方法只能用于含有半胱氨酸的多肽标记和两组样品间的比较。iTRAQ可高效率标记赖氨酸残基和N末端的氨基，能同时进行4～8种样品的比较分析，而且适用于所有来源的蛋白质样品，因此在进行多个样品分析时具有明显优势。MALDI和ESI是iTRAQ标记样品分析中常用的仪器，这两种仪器不仅采用不同的离子源，而且质量分析器构成也不同。前者的质量分析器是由两个飞行时间(Time of flight, TOF)分析器组成，后者的质量分析器则由一个四极杆和一个TOF质量分析器组成。已有研究者对上述两种仪器在大肠杆菌DNA结合蛋白质鉴定上的性能进行过比较[9]，但至今未见有关两种类型仪器在复杂蛋白质混合物定量分析上的性能比较报道。为了比较这两种仪器在iTRAQ标记样品分析中的性能，本实验设计利用iTRAQ标记的雌二醇刺激前后的MCF7细胞内蛋白质来评估MALDI和ESI的分析性能。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　HP1200毛细管液相色谱系统(美国Agilent公司); QStar XL MS/MS系统、Tempo Nano分离点靶系统和4800 MALDI蛋白质分析仪(美国Applied Biosystems公司)。 　　雌激素受体阳性(ER+)的人乳腺癌细胞株MCF上海市肿瘤所);RPMI培养基干粉、胎牛血清和胰蛋白酶(美国Gibco公司);17β雌二醇(17β，美国Sigma公司);蛋白浓度测定试剂Dc Protein Assay(美国Bio公司);iTRAQ Reagent Multi美国Applied Biosystems公司);HPLC级超纯水和乙腈(美国Merk公司);其它试剂均为色谱纯。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 细胞培养与蛋白质抽提 MCF细胞株用含10%胎牛血清的RPMI40培养液在含5% CO2的37 ℃孵箱中培养，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。17β雌二醇用无水乙醇溶解后制成1.0 g/L的储存液，于-80 ℃冰箱中保存