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大鼠睫状神经营养因子siRNA的设计及其有效性验证的体外实验方法_临床医学论文 大鼠睫状神经营养因子siRNA的设计及其有效性验证的体外实验方法_临床医学论文 作者：郑翔， 李瑛， 孙运花， 丁艳， 毕文杰， 周雪 【关键词】 RNA干扰; 睫状神经营养因子(CNTF); 大鼠; 体外实验 RNA干扰(RNAi)是近年发展起来的一项具有巨大医疗应用潜力的反向遗传学技术[1]。该技术有双链干扰RNA设计与合成、序列有效性的体外实验验证和体内实验等重要环节[2]。其中，前两个环节是保证实验成功的先决条件。与植物和低等动物不同，在哺乳动物细胞内进行RNA干扰的条件更加苛刻，尚存在许多困难。比如，体外实验中，小干扰RNA(siRNA)的设计和有效性验证必须依据特定的规律[3-5]，并且对操作的要求较高。尽管如此，我们在实验中不断总结经验教训，认为很多siRNA的设计、合成和效应验证在操作上有很强的规律可循，具备一定经验后就能事半功倍。因此，我们以大鼠睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)的RNA干扰为例，介绍siRNA设计合成及其体外有效性验证的全过程，，希望这些经验能够为其他实验人员提供一些有帮助的信息。 　　1 材料和方法 　　1.1 大鼠CNTF siRNA分子的设计合成和修饰 　　在PubMed主页(网址http:∥2 结 果 　　2.1 经过传代和Lipofectamine 2000处理后成纤维细胞的融合度最高，符合转染要求 　　经过传代和Lipofectamine 2000处理，如图1所示，施万细胞的融合度大大下降，嗅鞘细胞的融合度也明显降低，两者都不能满足常规siRNA转染的要求。成纤维细胞经过两次传代，细胞密度增加，细胞生长良好，满足转染要求。 　　2.2 在传代后16 h时进行转染操作，siRNA能够成功进入成纤维细胞 　　转染操作6 h后观察，如图2，传代后16 h转染组成纤维细胞90%以上带有红色荧光标记，证实siRNA已经成功转染成纤维细胞。传代后48 h转染组成纤维细胞很少见到荧光标记。 　　2.3 不同siRNA分子和不同转染条件下CNTF免疫荧光强度的变化 　　如图3所示，在传代后16 h进行转染操作，转染后24，48，72 h这3个时间点，3种核苷酸序列不同的siRNA分子所致的CNTF免疫荧光强度降低的程度是不同的。其中，siRNA2组各时间点CNTF免疫荧光强度无显著改变;siRNA1和siRNA3组可见在72 h时CNTF免疫荧光强度下降显著(0.01)，两组分别下降至对照siRNA转染组的82%和61%。 　　2.4 siRNA3转染后CNTF mRNA水平显著下降 　　如图4，5，经RT分析可见，siRNA3转染后24 h，成纤维细胞的CNTF mRNA已经显著降低到对照siRNA转染组的14%，此后一直维持低水平。 　　3 讨 论 　　本实验的主要内容为RNA干扰技术中siRNA的设计和有效性检验环节的操作。通过一系列操作，成功筛选出针对大鼠CNTF的相对有效的siRNA3分子，并在最佳条件下使体外培养的成纤维细胞的CNTF mRNA和蛋白水平分别降低到对照siRNA转染组的14%和61%。 　　在包括CNTF等多种分子在内的RNAi实验中，我们根据操作经验，总结出大致相似的如下几个步骤。首先，根据目标蛋白的mRNA全长序列，按照经验规则[3-5]选择候选靶序列及其对照序列，并完成同源性检测;靶序列一般选择3个，如果后续试验发现全部无效再作补充，否则数量多了会大大增加开支。选择靶序列和设计siRNA有很多自动化工具可用，我们应用后认为Invitrogen公司的BLOCKr比较全面和方便。此外，像麻省理工学院Whitehead研究所的siRNA设计程序和日本基因网SiDirect siRNA序列分析程序等得出的结果也值得参考，以上程序都可以在互联网上免费使用。siRNA分子可以是传统的19nt加上等突出尾巴，也可以不采用19nt突出结构，评判是否有效的唯一方法就是通过实验验证。第二，根据靶序列设计出siRNA分子，确定siRNA分子的修饰类型，并交由专门的公司或实验室合成;siRNA合成修饰不是本文的重点内容，大多数研究形态或者功能的实验室也不需要常规进行这些操作。第三，通过文献查阅确定哪些细胞表达目标蛋白，然后用体外培养预实验确定：这些细胞中哪种或哪些细胞既能表达目标蛋白又比较容易转染。需要注意的是，为了检测细胞的生长特性和存活能力，传代过程不要降低细胞的总数。比如本实验通过体外培养发现，成纤维细胞高表达CNTF，而且传代后经过Lipofectamine 2000作用，仍然能生长和增殖，最符合转染操作的要求。如果有现成的细胞株或细胞系可以利用，