E3L缺失型天坛株痘苗病毒减毒载体的构建及筛选.pdfVIP

第四次猪病学术研讨会会议论文集 基因卜游一小段lacZ’片段与完整的lacz基冈发生分子内的同源重组，从而丢失neo基因和lacZ基因， 最终获得能表达外源基因并且删除了9市选标记基因的重组痘苗病毒。但是，痘苗病毒发生同源重组 的概率很低，特别是发生存LacZ同源序列问的第二次同源重组的概率更低，这无疑给筛选工作带来 较大压力ll引。另外，该方法也没有将相关筛选基冈彻底删除。 本实验通过分析痘苗病毒天坛株全基冈组，设计出重组臂TKL和TKR，并且将病毒本身TK基 因筛选系统【7】和绿色荧光蛋白基因作为筛选标记基冈。我们成功构建了含有筛选基因表达盒 方法，依靠Brdu加压和在荧光显微镜下的观察，筛选到整个标记基凶表达盒插入到TK笨冈位置的 重组痘苗病毒。以Cre茕组酶能够识别特定的loXp序列，能够将两个同向loxp序列间的EGFP筛选标 记基冈有效l州涂为依【l5|，经过pVAxl．Cre质粒与收获的rTTWTK。EGFP共转染BHK．21细胞，鉴定 结果农明，彻底删除了标记基因EGFP。从而，成功筛选出删除了TK基凶和标记基冈EGFP的重组 痘苗病毒rTTVV TK．。与G418．Neo及旋／白斑双重筛选法比较，我们利用Cre．Ioxp系统特意性地将筛 选基因EGFP彻底删除，并且删除筛选基冈的过程比较简捷方便。 观、简捷方便，这不但为疱笛病毒载体的筛选提供了。种方法，而日．避免把与日的基因或疫苗无关 的成分带进最终的制品，有利丁：提高牛物制品应用的安全性。 参考文献(略) E3L缺失型天坛株痘苗病毒减毒载体的构建及筛选 王宇航李霄阚式绂王卓越 齐延新杜寿丈金宁一 (军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062) 摘要 利用PcR技术、DNA克隆技术构建携带有痘病毒早晚期强力复合启动子(PE／L)，天坛株痘苗病毒E3L 粒pvAx 蛋白筛选并连续蚀斑纯化含EGFP的重组病毒(rTlVVTE‘．EGFP)，而后与pⅥ垅I．cre共转染BHK一2】细胞，挑取 单个无荧光蚀斑，纯化并应用PCR技术进行鉴定。结果成功筛选并获得E3L基因缺失天坛株减毒载体(rTTvVTE’)． 关键词 E3L；重组痘苗病毒；Cre，Loxp；减毒 痘苗病毒(Vaccina 病毒，其基I列组较大，含有大量的怍必须基因，可载入大片段的外源基冈，而H基因T程操作方便， 适于作为病毒载体用丁．各种疾病的防控…。自1982年首次将外源基冈插入痘苗病毒进行表达以来， 痘苗病毒被J1．泛用丁多种疾病病原体抗原基因的表达载体或重组活病毒载体疫苗的研刭卜。j。目前， HBV、HlV、狂犬病毒等病原体的抗原基因已通过重组痘苗病毒疫苗的形式得到成功表达，而HHBV 表面抗原基因重组痘苗病毒疫苗已在我凼获得新药证书并在国内上市。痘苗病毒大坛株毒力相对较 弱，使用安伞，足适用于我国应用的基凶上程减毒疫苗株的理想毒株。 E3L基因为痘苗病毒复制非必需基因，抑制干扰素的抗病毒效能。该基因序列的IFN抗性基因 在病毒感染早期编码25KDa的多从。E3L缺失型癔蚯病毒突变株对fFN．邮抗病毒活性显示出高度敏 【5】。E3L氨荩端结构域对于病毒对体外培养细胞的感染性是非必需的，但其氨基端和羧基端对于病 毒在小鼠体内完全的致病性是必须的。N末端对致病性起重要作用，另外VACVE3L蛋白包含的C． 的dsRNA可作为分子病原体，导致前炎性凶子信号转导、干扰素和其他前炎症冈子基凶的表达，以 及干扰素诱导抗病毒蛋白的活化【州。 本实验应用同源醺组的理论和技术，以痘苗病毒天坛株作为改造对象，构建了E3L基因缺失型 天坛株瘦曲．病毒减毒载体，并利用EGFP绿色荧光蛋白和缺失E3L双重标记对E3L缺陷型病毒进行了 其他论文 筛选，为将来应用天坛株痘苗病毒作为外源基因表达系统或用丁：构建蘑组活病毒疫苗的研究奠定了 基础。 l材料与方法 1．1质粒、毒株及细胞 II I表达载体由本实 pBhles“ptⅡSK-GFP、pBluesriptⅡSK-Cre、pBlues啷tSKP—sfi．PTE、pVAX 验室保存；痘苗病毒天坛株(TTW)为本实验窒保存，BHK-21细胞由本室保存。 1．2主要试剂和仪器 2000