检测猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立与初步应用.pdfVIP

第三届南京农业大学畜牧兽医学术年会论文集 检测猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量 RT—PCR方法的建立与初步应用 徐丽秋1，苏永生2，赵玉军1，刘海防3， 高玉峰4，王长文2，贾赘2。 (1．沈阳农业大学动科院，辽宁沈阳110161； 2．辽宁出入境检验检疫局，辽宁大连116001； 3．山东农业大学动科院，山东泰安271018； 4．大连工业大学生物与食品工程学院．辽宁大连116034) 化，建立了一种特异、灵敏、快速的TaqMan荧光定量RT—PCR方法来检测TGEV。与国外进口的Animal 检测。结果阳性率为24％。试验证明，所建立方法适用于猪传染性胃肠炎病毒的分子诊断、流行病学调查等相关研究。 关键词：猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)；实时定量RT-PCR；TaqMan荧光探针 猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritis监察所，猪伪狂犬病毒(PRV)容A株由南京农业 virus，TGEV)是引起仔猪腹泻的重要病毒性传染原，大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室惠 感染猪的主要临床症状是腹泻、呕吐和脱水，患病幼 赠；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株、 仔猪死亡率极高，可以达到100％，给养猪业造成了 巨大的经济损失。因此开展TGEV诊断方法和相关基sT传代细胞系为本实验室留存。 因功能的研究非常重要。TGEV属冠状病毒科冠状病1．2试剂与仪器 coli 毒属成员，是单股正链RNA病毒，基因组全长28．6 M·MLV反转录酶、pGEM—T载体、ECompe． tentCell GelExtraction kb，共有7个开放阅读框(ORF)，其中编码核衣壳 JMl09、OMEGA Kit、TaKaRa、 OMEGAPlasmidMini Marker 蛋白的N基因高度保守¨1。 Kit、DNA DL2000、 TaKaRa 检测TGEV的常规方法主要有病毒的分离鉴定、 TaqⅢ等常规分子生物学试剂购自宝生物(大 免疫荧光抗体试验、病毒中和试验、电镜观察、免疫 连)工程有限公司；TGEV抗原快速检测试剂盒(免 疫层析法)，购自韩国Animal 电镜观察、ELISA嵋J、核酸探针杂交口1、普通RT· PCR[4】、多重RT．PCR”1技术等，但是这些技术操作 繁琐，周期长，或者只能进行定性检测而不能定量分 仪是宝生物工程(大连)有限公司产品，紫外分光 析，并且有时灵敏性不够。实时荧光定量RT-PCR技光度计为PE公司产品，凝胶成像系统购于Bio．Rad 术兼备核酸高效扩增、光谱技术的高敏感性和高精确 公司。 定量、灵敏度高、特异性好等优点，且不易造成交叉 1．3引物与探针 污染、重复性好，检测出结果快，与普通RT—PCR相 根据本实验室保存的TGEVMiller毒株的N基因 比具有明显的优势，在病原体的定性和定量检测等方 面已得到广泛应用。为此我们建立了针对TGEV的基因序列，用生物学软件比较分析设计引物和探针， 目的片段大小为103 TaqMan荧光定量RT—PCR检测方法，为TGEV感染 bp。 TGEV 的早期诊断及流行病学调查