AIDS相关支原体的分子检测探究.pdfVIP

合素融可以介导致病的Hv感染，这一感染抗岛抗体或配基一VN所阻断；②用整合素的配基一纤连蛋 白(州)或抗郇岛整合素抗体可以抑制非致病的PHV的感染，而后者的感染却不被抗岛的抗体或VN 抑制；③将。Ⅱ8或。，岛整合素的基因导人岛整合紊缺乏的细胞，该细胞对致病的H、r易感；④这种整合 素陬介导的人胞作用即不依赖于二价钙离子，也不依赖于RGD基序，表明HV与整合素特定的区域结 合或需要更复杂的细胞表面蛋白来辅助其入胞；⑤应用人源化的抗∞特异Fab片段，能抑制致病的HV 对细胞的感染；⑥Hv的致病毒株与非致病毒株感染均可上词内皮细胞表面岛和融整合素受体的数量； ⑦致病的Ifv及抗岛整合素的抗体可阻断整合素配体VN引起的含有岛整合素的内皮细胞的移动，而后 者是机体维持内皮细胞完整性的重要功能，但是对含Bl类整合素的内皮细胞无效；⑧非致病HV不能 阻止由岛和岛整合素配体引起的内皮细胞移动。上述研究表明，整合素岛可能是HV的重要的粘附受 体之一。并且与本病的血管通透性改变及血小板功能异常等致病机制有关。 为r进一步探讨整合素∞作为Hv受体的特异性，本文构建了人整合素田亚基ORF基因真核表达 andaccurate 载体。在实验中我们参照LA—PCR(10ng PCR)方法，一次性、较精确地扩增出2．3kb长的 核苷酸片断，具体优化措施如下：(1)引物设计：①高度特异性，与模板DNA特异性匹配是实现大片 断扩增的关键；②复性温度应60。C，使退火温度与延伸温度接近，以提高扩增的特异性和效率；③长 增高拷贝模板)。(2)模板完整性，对于LA—PCR至关重要，目前市售的小量质粒抽提纯化试剂盒一般 采用大孔透析或阴离子交换树脂等方法，较传统的酚：氯仿抽提法更好地保持模板DNA的完整性。(3) 温度循环参数：①变性温度尽可能低(94℃)，变性时间不应太长(≤60s)；②适当增加延伸时间；③ 热启动，在高温(70℃左右)下使酶、模板与引物混合，避免PCR中引物与模板非特异性复性和扩增， 性、退火和延伸温度，能最快的实现管内不同温度的变化，并使用薄壁管，加快热的穿透和平衡。但由 于Taq聚合酶本身催化的反应的碱基错误掺入率可高达10“／碱基／循环，在扩增2．3kb片段中出现3个 碱基的错配是在所难免的，故要扩增长而精确的片段，选取具有37—5，夕r切核酸酶活性的DNA聚合酶 TA克隆 真核表达载体，以其定向、迅速、简捷、高效著称，但由于我们克隆人的片段较长(1．okb)，加之与 Shot。TOPl0 其配套的赢效的One ChronicallyCompetent感受态细菌在多次冻融后失效。最初按其操作说明 进行连接、转化的结果不理想，经过适当的改进一如增加目的基因PCR回收产物的用量、扩大连接体 系、延长连接时间，并自制新鲜感受态细菌，在其转化效率最高的时间段(制备后的12。24小时)进 NA3．1一∞真核表达载体。 人整合素∞旺基真核表达载体的成功构建，为进一步研究HV感染的宿主范围、组织或细胞嗜性， 从分子水平阐明病毒的吸附机理和传播方式及致病机制奠定了基础。 B8AIDS相关支原体的分子检测研究 静瞪，店：] 无锡市克隆遗传技术研究所(214026)糜祖煌秦玲 支原体(M 子。最近，我国支原体学专家赵季文等也成功地从HIV感染者和AIDS患者之尿液中分别分离到Mf和 Mpe。本史以支原体16St RNA基因(即16Sr ——84———— 快速的分子检测方法。魄将方法与结果报告如下。 。夕 材料与方法 一、材料 1．支原体菌种来源：解脲脲原体(Ureaplasrna 究所细菌室郭章溉研究员提供；Mpe和Mpi典型株培养液由中华微生物与免疫学会支原体学组赵季文主 任委薅提供。其它用作nPCR特异性试验的细菌和衣原体以及病毒菌种均为本所保有菌种。 2．分子生物学试剂来源：Taq 技术公司提供。DNA序列测定核心试剂为美国PE公司产品。 3．临床标本来源：STD者尿道拭子来自扬州市皮防所(扬大医学院孙蓉老师提供)