ELISA检测乳中牛结核抗体地研究.pdfVIP

ELI sA检测乳中牛结核抗体的研究 徐风宇， 高云航， 何昭阳· 3011 (吉林农业大学动物科技学院，吉林长春1 8) 应激等优点，它可以作为奶牛结核病的初筛试验。 关键词：牛结核病 牛乳酶联免疫吸附试验 结核病是由结核分支杆菌所引起的一种严重的人畜共患的慢性传染病，曾经是人类历史上最猖獗的传 染病之～。本试验以牛乳为试验材料，建立一种诊断牛结核病的间接ELISA方法，目的是为诊断牛结核 病找到一种更快捷、简便的方法，减少人力资源的投入，减轻医务工作者的劳动强度，便于ELISA方法在 临床上应用。 1 材料与方法 1．1材料 1．1．1抗原牛结核PPD，购于黑龙江省生物制品一厂。批号：9902。 1．1．2牛乳阳性牛乳为牛结核变态反应阳性，涂片镜检或细菌分离培养呈阳性，其血清经多次ELISA 检测oD值大于临界值的病牛的牛乳。阴性牛乳为牛结核变态反应阴性，细菌学检查呈阴性，其血清经多 次ELISA检测OD值小于I临界值的健康牛的牛乳。 1．2方法 1．2．1兔抗牛抗体的制备按照常规方法进行。 1．2．2兔抗牛IgG酶标抗体的制备按照常规方法进行。 1．2．3常规牛结核血清ELISA方法参照逢魁春方法进行。 1．2．4牛乳的前处理 1．2．4．1全乳与脱脂乳的试验效果比较 000 将全乳分别置于4℃的冰箱中静止24h去乳脂、2r／min离心lOmin处理后去乳脂，将两种方法 处理后的脱脂乳和全乳分别做ELISA试验，比较其结果。 1．2．4．2去酪蛋白前后的效果比较 min、12 min等不同离 min、8 000r／min离心30 将脱脂乳进行4000r／min离心30000r／min离心30 心条件的处理，同时设对照组，找出最适离心条件。同时将脱脂乳用盐酸进行处理，观察其去除酪蛋白的效 果。 1．2．5牛乳ELISA检测方法 1，37C温育 以0．01mol／1 g／ml，用加样器每孔加入100 pH9．6的碳酸盐缓冲液将PPD稀释成30 适当稀释，每孔加入100 度，每孔加入100 i00 1，37e温育40min，3x3’洗涤。加入新鲜配制的底物OPD 1，37℃湿盒避光作用 30min。加入终止液50 板同时设标准阴性，标准阳性及空白对照。被检样品的OD值／标准阴性样品的on值≥2．0时，判定被检 样品为阳性。 1．2．6特异性试验 1．2．6．1阻断试验 以抗原包被反应板，取结核标准阳性牛乳三份。其中两份分别与过量的草分支杆菌于粉、牛结核分支 杆菌干粉混合，37C感作2h，中间不时振荡，然后离心去除沉淀物，检测其oD值。 1．2．6．2交叉反应试验 取5份副结核病牛牛乳根据本法做ELISA试验，检测其结果。 1．2．6．3符合性试验 取已知牛结核m清ELISA阴性牛乳112份，根据本法做牛乳ELISA试验，检测其结果。 I．2．7敏感性试验 对24头份结核血清ELISA反应阳性牛乳，做牛乳ELISA，检测其结果。 1．2．8重复性试验 检测其结果。同时将结核阴、阳性牛乳连续三次做ELISA试验，检测其结果。 1．2．9稳定性试验 将结核阴、阳性牛乳分别冻融1次、2次、3次，进行ELISA试验。同时将结核阴、阳性牛乳分别加 热至65℃持续30min、74C持续lOmin后，与未加热的阴阳性牛乳进行对照。 2 结