c-fos、c-mybt和c-erbB-2和大鼠卵巢颗粒细胞生孕酮调控关系的研究.pdfVIP

、 一 不llI erb c-fo．,、C—myb和c-erbB-2C-TOS Yb 与匀 大鼠卵巢颗粒细胞生孕酮调控关系的研究 郑月慧钟志胜方廉金萱况海斌 摘 有各自癌基因蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率下降；而无义tatODN没有相应的作用。2×lO-Tmot／L X 内皮素一1和510‘6mol／L Y一氨基丁酸能显著抑制hOG诱导颗粒细胞孕酮的产生，同时使c-fos、 0-6t001／L维拉帕米对hCG诱导颗 c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率下降；而1×1 酸能通过调节这些癌基因在颗粒细胞中的表达而影响hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生；而Ca”无相应 的作用。 关键词：癌基因、反义寡脱氧核苷酸、颗粒细胞、孕酮 有资料表明，原癌基因参与性腺功能的调控【l】。在大鼠离体黄体细胞的体外实验中，我们已观察 为在调节卵巢功能中起重要作用的物质如内皮烈引、Y．氨基丁酸【_7】和钙离子等有何关系还不清楚。 ODN对大鼠排卵前卵泡颗粒细胞生孕酮作用的影 为此本文观察了反义c．fos、c-myb和c-erbB．2 以进一步了解卵巢的生理调控机制。 1．材科和方法 1．1主要试剂 E essential I-N药品株式会社产品)；MM(minimummedium)培养液(美国LifeTechonologies提供)， 内加25mmol／L S Hepes和0．5％B TGTTcTCGGGTTTcAA 海生物工程中心合成)。反义c．fosODN序列为5’．A c-3’； TGTCGGGGTCTCCGGGC．3’：反义c—erbB一20DN序 反义e-mybODN序列为5’．G AGCTCCATGGTGCT ATTTCTTG 列为5’一C 3’：无义tatODN序列为5’C CTCTCC 3’，以之作为对照。上述ODN均硫代磷酸修饰；内皮素．I(ET．1)分子量为 AB 2491．9(Sigma公司产品)；Y-氨基丁酸(Y．GA)分子量为103．12(Sigma公司产品)；维拉帕米 ．252． 1．2动物模型及颗粒细胞孵育 50 选用2529d龄未成年健康雌性SD大白鼠，每鼠皮下注射(sc)PMSGIU，48h后断头处死， 迅速取出卵巢，放在冰冷的MEM培养液中，用眼科手术刀或针尖刺破卵泡后再轻轻挤压，释放颗粒 细胞于MEM培养液内，此后操作按文献【8l进行。分装成每管含活细胞5X108个／L，预孵育15min 后，加入处理试剂，继续孵育4h，将细胞悬液4℃，250g离心10min，取上清液贮于．20C待测孕酮；细 胞沉淀涂于玻片上，用2％的多聚甲醛固定，干后，贮于4℃待测细胞内相应的癌基因蛋白。 1．3测试方法 酮：用放射免疫分析法(RIA)测定，放免药盒由天津九鼎医学生物工程有限公司提供。测定时设有内、 基因蛋白：用LSAB(Labelled 2 免疫球蛋白，三抗为过氧化酶标记的抗生蛋白链菌素(LSAB)。基本步骤为：细胞固定后，用3％H20 封闭内源性过氧化酶和10％正常血清封闭非特性抗原，滴加1：100一抗4℃24h时，阴性对照用正 显色4一-5min，以上各步之间用PBS充分浸洗。最后脱水、透明、封片、镜检。染色阳性细胞为深 棕色，每片至少计算100个细胞算出染色阳性细胞的百分率。