色谱-质谱方法的研究吸烟人群代谢物.pdfVIP

全国生物医药色谱学术交流会(2008)论文集 E07色谱一质谱方法研究吸烟人群代谢物 何智慧1王媛2张风霞2许国旺2练文柳1罗嘉1 1．湖南中烟工业公司技术中心(长沙卷烟厂科研所)，长沙，410007， 2． 中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心，大连，116023 代谢组学是近年来生命科学领域研究的一大热点Ilj。它通过研究生物体对病理生理刺激或 基因修饰产生的代谢物质的质和量的动态变化，将先进的样品分析手段和多变量数据处理方 法整合到一起，从整体角度评价生物体代谢状态的波动，从而更深刻地理解生命过型21。液相 色谱．质谱(船LC-MS)技术已被广泛应用于疾病诊断和新型标记物发现、药物发现和毒性研 究、流行病学和营养学研究，以及植物和微生物代谢组学研究等领域J。烟草燃烧产生多种有 毒物质，一般认为吸烟会导致多种肺部疾病、心血管疾病以及癌症等。目前尚没有应用代谢 组学研究手段考察吸烟对人体整体代谢状态和健康影响的报告。本文首次利用代谢组学的观 点和技术，研究了吸烟对健康人群代谢状态的影响。 实验人群为19—25岁男性志愿者，无心脏、肺、肝等内脏疾病，有2．8年持续吸食史。样 品取晨尿中断，并贮存于．80℃。样品经逐级解冻后加入混合有机溶剂漩涡混匀后静置1小时， 高速离心14分钟去蛋白，上清液冻千后重新溶于l札混合溶液中，过微滤膜待测。在Agilent 1100液相色谱仪上完成样品的液相色谱分离过程。流动相A为0．1％甲酸水溶液，流动相B 为乙腈，梯度洗脱，流速200laL／min，上样量5uL，柱温保持30℃。流动相经柱后分流为120 }tL／min，导入线性离子阱质谱仪进行检测。离子源温度250℃，氮气用作气帘气、雾化气和辅 助加热气，碰撞裂解气设为Low，分别在正、负离子模式下用增强型MS全扫模式(EMS) 检测样品中所有m／z100．800范围内的小分子代谢物。样品中的肌酐含量用液相色谱法测定。 检测到的所有代谢物组分由MarkerViewTM软件导出并合并峰表。为校正代谢物在不同个 体样品中浓度的差别，将每个代谢物的响应转变为相对于其肌酐含量的浓度，再根据“80％规 则”去除缺失值，校正后的峰表代入SIMCA．P11．0软件进行后续的多变量数据处理过程。对于 那些经多变量数据处理过程找出的区分吸烟人群和非吸烟人群代谢状态差异的潜在生物标记 物，通过多级质谱得到结构信息，辅以文献查阅、数据库检索和标准样品验证等手段结合进 行定性。 图l和图2分别给出了非吸烟和吸烟健康人尿样的色谱一质谱谱图。由图中可以看出， 和非吸烟人相比，吸烟后尿样的代谢组分种类和浓度发生了一定程度的改变，说明吸烟对人 体的整体代谢状态会产生一定的影响。 图1．非吸烟健康人尿样色谱．质谱潜图 图2．吸烟健康人尿样色谱．质谱谱图 从图l，2中还可以看出，在不同的离子检测模式下同一个样品的谱图也有差别，这种差别是由 255 全国生物医药色谱学术交流会(2008)论文集 于不同的代谢产物在不同离子状态下响应不同造成的。经过合并峰表及去除缺失值，在正离子模式下 检出了1019个代谢物，在负离子模式下检出了303个代谢物。将检出的代谢物进行偏最小二乘一模式 识别(PLS—DA)聚类分析，得到如图3所示的样品分类图(得分图)和变量分布图(载荷图)。由得 分图可以看出，受试健康吸烟者可以通过模式识别和非吸烟者区别开来，但这种区别并不十分明显。 这可能是受试吸烟者为烟龄较短的青年，新陈代谢旺盛，身体状况良好，吸烟尚未对健康产生显著影 响。在载荷图上，那些对分类贡献较大的变量(即代谢物)往往分散在变量聚集区以外，通过计算这 些变量的“重要性投影”指标(variable importanceprojection，VIP)，可以量化每个变量对分类的贡献。 文中，那些VP值大于2．0的变量被认为是可能的潜在标记物。在此基础上，通过另一种名为“S．plot” 的多变量数据处理技术对这些潜在标记物的可靠性进行了判别，那些在S．plot中体现出过小相关系数 以及过大置信区间的变量被剔除，尽管它们可能有很高的VIP值。 、；黧翟曲8 ＼