杀菌剂长川霉素的分离提取的研究.pdfVIP

第六届全国农药交流会论文集 9 杀菌剂长川霉素的分离提取研究 陶黎明，顾学斌，徐文平，王磊 (上海市农药研究所) 在筛选新的农用抗生素的过程中，从广西地区土壤中分离得到sPRI．2098菌株，其发酵产生的代谢产 物长川霉素对黄瓜灰霉病等真菌病害有较好的防治效果。 本文主要就长川霉素的提取工艺研究作一小结。 1实验与方法 于4℃冰箱备用，种子和发酵培养基(葡萄糖5g，淀粉5g，牛肉膏5g，蛋自胨10g，氯化钠5g，水1000 mL三角摇瓶(装载50mL培养基)，28*(2培养2d，按照 mL，pH7．0)从斜面上挑取菌种，接种于250 5％～10％的接种量，接种于发酵摇瓶(50mL／250mL)，28℃培养4天。(配方同上) 1．1发酵液的预处理 发酵结束后，发酵液中抗生素效价不高，而杂质含量很高，包括大量的菌体细胞，未用完的培养基．各 种胥自质、胶状物、色素、金属离子以及其它代谢物。这些杂质直接影响活性组分的提取，所以必须预处 理。发酵液的预处理方法有很多，主要根据菌株发酵液本身的性质应用机械离心固液分离、膜过滤、溶剂 处理、高温处理、酸碱沉淀、甲醇沉淀等方法，最终目的是为了能够顺利进行后续操作的展开。本研究课 题是采用了冷冻高速离心的的方法，分出上清液和菌丝体，待用。 1．2发酵液菌丝体有机溶剂萃取实验 上述已经提到很多抗生素发酵产物可能存在于菌丝体内，为了将菌丝体内的活性物质长川霉索分离出 来，有机溶齐Ⅱ萃取是一个非常有用的方法，其往往是用一些有机溶剂或者有机溶剂水溶液进行操作。萃取 溶剂的选择一般遵循“相似相溶”的原则，其次本着安全、价廉的原则。根据这两个原则，我们选择了丙 酮、乙醇、水作为浸泡溶剂。 1．3辩脂吸附浓缩实验 吸附树脂的使用方法：一、树脂保存方法；吸附树脂一般采用湿态保存，存放处的温度为0～40C， 当存放的温度低于O℃时要向包装袋内加入澄清的饱和食盐水。如果暴露在空气中，树脂可能部分干燥失 水，由于吸附树脂大多数是疏水性的，为使树脂再度水合，应把部分失水的树脂放入甲醇中或其他水溶性 溶剂中充分浸泡，然后用水冲洗置换出甲醇。二、树脂预处理：在吸附树脂生产过程中一般采用工业级原 料，产品没有经过进一步纯化处理，因此树脂的内部往往留有少量单体、致孔剂和其它有机杂质，使用之 前必须处理。方法如下：1、将准备装柱的树脂用2倍左右体积的甲醇或其他水溶性溶剂(如乙醇、丙酮) 浸泡2h并不时搅动使树脂溶胀。2、将已充分溶胀的树脂装柱，以每小时3～4倍体积的流速将548倍的甲 醇或其它水溶性溶剂如乙醇、丙酮)通过树脂层，至流出液加水稀释不变混。3、甲醇处理后以每小时64 8倍体积的流速将去离子水通过树脂层，置换出甲醇即可投入使用。 为了验证各种树脂对SPRI-231有效组分能否吸附，我们特意选择了各种类型的典型树脂，大孔吸附 树脂：1300、HZ803、HZ816、HZ841等。 各树脂的物理化学结构参数如表1。 mm×500 mL 树脂吸附解吸的方法：将已装好的树脂柱(20 mm)按照上述的处理方法处理完毕，将100 10 优秀心文 菌丝体浸取液通过树脂柱，吸附以后，依次通入不同解吸液，收集浓缩，大孔吸附树脂使用水溶液、25％ 甲醇溶液、50％醇溶液、75％EF醇溶液解吸。 表1 大孔吸附树脂的物理化学结构参数 注：HZ803，1300、HZ816为非极性，HZ841为弱极性。 2结果与分析 2．1发酵液上清液及菌丝体活性的分布结果 取发酵液5mL离心，上清液和菌丝体浸泡液分别作HPLC外标法测定，结果表示，现有的产生菌所产 生的长川霉素总量的10％存在于发酵液的上清液内，90％存在于菌丝体内，所以一般测定菌丝体溶剂抽提液。 表2抗生素在发酵液中的分布 2．2菌丝体液固萃取溶剂的浸取效果 在抗生素提取研究中，通常采用80％丙酮或80％乙醇抽