汉坦病毒浙江分离株的分子生物学的研究.pdfVIP

汉坦病毒浙江分离株的分子生物学研究 杭州浙江省疾病预防控制中心病毒研究所浙江省肾综合征出血热重点实验室(310009) 姚苹苹朱函坪徐芳朱智勇 720C120 汉坦病毒(hantavlrus)是引起肾综合征出血热s，30个循环，72℃延长10mm。。(3)目的片 (m璐)的病原体，属布尼亚病毒科，自1976年分离 段的克隆和筛选：用Agrose胶提取试剂盒提取目的 到该病毒以来，已知它至少有8个血清型，我国至少 片段，分别克隆人pUCm-T质粒载体，转化Ecoli 存在2个血清型，即野鼠型(m：N型)和家鼠型(SEOD地。，经含氨苄青霉素、x—gal和IFIG的培养基筛 型)。ZJ4、ZJ7株是2001～2002年本课题组从浙江选，碱法提取质粒。 省的HFRS疫区鼠肺中分离并筛选出来的毒株， 5．核苷酸序列测定和分析；在ABI自动测序仪 HTN型Z10株病毒是本实验室在80年代初从浙江从正反两个方向分别进行测序，将得到的核苷酸序 一名患者血清中分离得到，现已用于生产HFRS野列与GenBank中的HTN型病毒序列进行比较。应 鼠型沙鼠肾细胞灭活疫苗的毒株。本研究应用RT- 用DNA 行序列比较及绘出种系发生树。 PCR方法扩增出ZJ4、ZJ7株部分M基因片段，分别 克隆入pUCm-T质粒载体后，进行核苷酸序列测定， 结 果 并与20年前分离到的Z10疫苗株M片段的序列进 行比较，可了解该病毒的变异程度，从而对疫苗的制 1．PCR扩增产物的检测：采用RT-PCR方法，从 造提供理论根据。 病毒细胞培养物提取的RNA，经一次扩增即获得了 3．6 kb大小的片段，与预计的M基因片段大小一 材料和方法 致，将这一片段克隆到pUCm-T载体中进行酶切和 PCR鉴定，结果与期望一致，经测定其序列，结果为 re． 1．主要试剂：总RNA提取试剂液(trizol agent)、逆转录酶M—MLV购自Invitrogen公司，Agrose 片段2003～2300nt处300 胶提取试剂盒、质粒提取试剂盒、Taq酶及质粒载体 bp的核苷酸序列。 pUCm-T购自上海生工公司。 2．病毒与细胞：ZJ4、zJ7毒株采用20d左右沙 较见表1。 鼠分离自浙江省I-IFRS疫区捕获的野外鼠鼠肺标 本，经I型、Ⅱ型汉坦病毒单克隆荧光抗体鉴定，属 表1 国内外HTN型病毒部分M片段核苷酸 HTN型病毒。Veto细胞由中国药品生物制品检定 序列同源性比较 所惠赠，经本室传代保存，Vero细胞使用代次不超过 150代，ZJ4、ZJ7毒株接种Vero单层细胞，培养7d， 病毒滴度达7．25LgTCIDso／ml，抗原滴度达1：640，收 获病毒培养上清液，用于RNA的提取。 3．RNA的提取：按Invitrogen公司的总RNA提 取试剂液操作说明进行病毒RNA的提取。 4．反转录与PCR扩增：(1)引物设计：参考已知 汉坦病毒株M片段核苷酸序列，设计3条引物：P1： 5-gacactaaatttgttcaga-3’；P2：5-teagagacaccattaacte一3’； P3：5-cttggactcatgatatctcc一3’。(2)PER扩增：在引物 Pl和M．MLV反转录酶作用下合成