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在有机介质中酶法合成功能短肽的研究 张学忠 (吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，长春130023) 近二十年来，随着非水酶学研究的深入与发展，酶在有机合成中的应用已日趋成熟，酶 促合成法较化学合成法显示了许多优越性Ⅲ。对于多肽合成来说，尽管化学合成法已有较长 的历史，而且迄今仍然是合成较大肽片段的基本方法，然而它却有难以克服的缺点，例如， 由于副反应，．很难对中间产物进行纯化，而且给产物的分离带来困难。相比之下，酶促肽键 的合成．其中包括较大肽段间的缩合，尤其是合成只含几个氨基酸的小肽片段，较传统的化 学合成法占有明显的优势。它的主要优点表现在反应条件温和，立体专一性强。不用侧链保 护基和几乎无副反应等。最近几年。利用各种来源的蛋白水解酶(偶尔也用脂肪酶)在非水 介质中合成各种功能短肽的研究已有不少报道(综述见【2】)。合成了若干有实际应用价值的 功能短肽，其中包括细胞粘附三肽pJ，低热量高甜度的甜味剂二肽141以及具有镇静作用的脑 啡肽五肽151等。利用酶反应器，连续合成某些功能短肽已接近生产规模【6I。 然而应该指出，酶促合成小肽，在方法学上仍然有一些限制，这是由非水酶催化的特殊 性所决定的。本文就利用酶法在有机介质中合成小肽所涉及的几个关键问题以及方法学上的 研究进展情况进行讨论，目的在于说明如何构建一个理想的反应体系，从而提高肽产物的收 率。 一．方法原理 目前，有两种有效的方法进行酶促肽的含成，即热力学控制下的肽键生成和动力学控制 下的肽键生成。 1．热力学控制的肽键生成 由蛋白水解酶催化的肽键水解反应在一定条件下可以逆转生成肽键。通过控制某些影响 化学平衡的因素，如有机辅助溶剂，温度以及不溶性产物等，使平衡向生成肽键方向移动， 使肽产物积累。这个过程比较慢，要几十个小时，肽产物才能达到极大值。 2．动力学控制的肽键生成 动力学控制的肽键生成，即非平衡合成。利用酶将N一保护氨基酸(或肽)酯的酰基转移 到一种适合的亲核试剂(如氨基酸酰胺)上，进行转酰基反应，而生成肽键。此过程很快， 在几十分钟内，肽产物转化可达极大值。 二．酶在有机溶剂中的稳定化 酶反应由传统的水相过渡到有机相，必须考虑的一个问题是酶的稳定性。影响因素是多 方面的，其中反应体系的水含量是影响酶稳定性的重要因素之一。在有机溶剂中．随着水含 量的增加，酶的稳定性将减弱。此外，溶剂的极性是影响酶稳定性的另一重要因素。一般来 说，疏水性强的有机溶剂对酶的伤害比较小。由于目标产物的不同，采用的有机溶剂系统也 应该有所不同。当采用与水互溶的有机溶剂系统时，加入适当浓度的与水互溶的某些化合物， 有利于增加酶的稳定性，例如，甘油和一些多元醇等，它们的作用是可以减少水的活度。当 采用水一水不互溶有机溶剂双相体系时，酶对各种有机溶剂的敏感程度差别也是很大的．一 般来说，也是极性弱的有机溶剂对酶的稳定性要比极性强的有利。 使酶在水一有机溶剂双相体系中稳定化的措施之一是使用固定化酶。制备固定化酶时有 关载体的选择和固定化方法直接影响酶的催化活性，从而影响肽的收率。我们利用木瓜蛋白 酶合成模型化台物Boc-Phe—ValOMe二肽时，为了考察固定化载体对该酶催化性质的直接影 42 响，使用了四种固定化载体，并用不同的方法将木瓜蛋白酶固定。我们发现自制的鸡卵清蛋 白载体给出最好的结果。二肽产率达94．5％I”。 在有机溶剂中，使酶稳定化的另一种措施是利用表面话性荆，形成反相胶束。本文也给 出具体例子。 三。合成小肽最佳反应体系的构建 酶稳定性的问题是非水酶催化的共性问题。在非水介质中，酶促肽键的生成，有它的特 殊性，其中包括底物的专～性，即不同肽键，要选择适当的酶。此外，还必须通过实验考察 各种因素对化学平衡的影响，从而建立一个针对某一特定肽键的最佳反应体系。在构建反应 体系的实践中，经常遇到的几个问题包括溶剂系统的选择，酶的稳定化，最佳水含量、pH和 离子强度，反应温度以及反应时间的确定等。 1．溶剂系统的选择 反应介质对酶活性的影响很大。在极性的，无水的有机溶剂中，酶分子要经历大的构象 变化而失去活性。有机溶剂极性可用一个参数LogP作为衡量指标【s1。LogP表示一种有机溶 剂在正辛醇～水两相溶液中的分配系数的对数。当Lo驴4时，反应介质有利于酶活性，是 理想的介质。而当LogP(2时，有机溶剂极性