抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测的研究.pdfVIP

，。。囝 2004学术年会 抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测研究 朱元招1一，李德发1，尹靖东1，王凤来1 中国农业大学农业部饲料工业中。，北京100094；2安徽技术师范学院，安徽凤阳233100 摘要：试验对大豆申所含转基因成分进行了定量测定。采用双链DNASYBRGreenI结合染料 实时荧光定量PCR技术，扩增编码大豆凝集素的内参照髓c基因和编码抗草甘膦转基因大豆中的外 据标准曲线方程计算样品中的转基因含量；同时作重现性和熔解曲线分析。结果表明，拓c和CaMV35s 基因标准曲线方程线性好，R2值分别达到o．9997和0．9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品 定量结果显示，实测值与实际值较接近，相对偏差5～11％。SYBRGreenI实时定量PCR方法可用 于定量测定大豆样品中所含的转基因比例。 关键词：实时定量PCR，SYBRGreenI荧光染料，抗草甘膦大豆，转基因标识 转基因标识制度的实施使消费者拥有知情权和选择权。2000年1月，135个国家对加贴标签说 明达成协议；欧盟(EC)49／2000号条例规定食品中含有超过1％的转基因成分时，必须在标签上做 出标示(European 是在中国境内销售的大豆及其制品若属转基因生物，就必须进行标识。转基因标识管理的关键是以 有效的定量检测方法为基础。普通定性PCR一是不能准确定量，另外较灵敏、容易交叉污染和产生 “终点法”定量，不能对扩增过程进行动态检测。目前较多应用TagMan实时荧光定量技术，由于 反应体系中荧光探针能与靶序列特异性杂交，检测准确性高，但同时存在淬灭不彻底、合成和标记 SYBRGreen 复杂、成本高、非特异性扩增不易区分等缺陷。本研究通过建立双链DNA I结合染料 PCR方法，以定量大豆中转基因成分的比例。 1材料与方法 1．1样品制备 1％、0．5％和0．1％等不同含量的标准转基因大豆，按照用于GMO检测的DNA抽提试剂盒(大连宝生 物工程有限公司)中的操作规程(略加改动)分别提取其基因组DNA。另取100％标准阳性RR转基 花椰菜花叶病毒启动子CaMV35s：并同步扩增大豆凝集素雎c基因，作为内对照。 1．2标准曲线制作 内对照k基因标准曲线：用提取的100％标准阳性RR转基因大豆DNA，以超纯水按5倍递级 稀释成20％、4％、o 8％和0．16％，进行PCR反应。以拷贝叛的自然对数值为横坐标，以ct值为纵 坐标，绘制标准曲线图，并求解回归方程。 16％ 外源CaMV35s基因标准曲线；与抬c基因的标准曲线制作方法相似，但是选取4％、o．8％、0 和O．032％共4个浓度梯度进行PCR扩增。 2004学术年会 1．3定量PCR扩增反应 CTCTACTCCACCCCCATCC一3’，5-GCCCATCTGCAA 引物序列：(r)LEF／LER引物：5-GCC GCClTI’rTTGTG一3’；预期扩增长118 AGTGGGATTGTGCGT ATCA。3‘，5-GAT CA。3’；预期扩增长195 bp的CaMV35s启动子。 PCR反应体系(20 laL)：10pL Green 聚合酶和SYBR 用灭菌超纯水补齐至20 uL。空白对照以超纯水代替模板DNA。 2 PCR反应条件：开始保温50。Cmin；预变性95℃8min；变性94℃20s，退火20s，延伸 72℃20s，其中／ec和oM阳如基因的退火温度分别为60℃和54℃；熔解81．5℃1