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流变特性和其它参数表征丝状菌发酵液细胞生长的研究 郝冬发 吴兆亮 胡滨 (河北工业大学生物工程系，天津300130) 摘要 准确、迅速和在线浏t细胞培养过程中的细胞t是深入研究细胞代谢控制的塞础。丝状菌培养 液因受不浓培养基以及细胞形态午因素千扰，其生长测定一立无法得到解决。本文对比几种不同细胞 生长测定方法，发现流丈特性参数随细她生长呈挽律变化，其中表观粘度和祠度系数可以用于丝状菌 发酵液细地生长的表征。 关.词 触变性 流变特性 干重 核酸 残枪 细胞生长 X r X 细胞生长的数量变化集中反映了细胞的生理生化特性，是细胞内外各种环境因素综合作用 的结果。在研究工业发酵过程中，选择培养液中生物量 (或繁殖数)的测定方法是及时确定细 胞生长变化规律和深人研究细胞代谢调控的基础。开发快速、准确特别是能实现在线化的测试 手段，对于生产研究及提高发酵工业自动化水平均具有重要意义’「一2〕。 在含有不溶培养基的丝状菌液态培养体系中，菌体细胞相互缠绕呈丝网状，很难进行传统 的细胞计数，其它测试手段如干重法、比浊法等因受不溶培养基及细胞形态色素等干扰而无法 直接测定。长期以来，丝状菌以及存在类似干扰因素的培养体系，其生长测量手段一直没有得 到很好的解决。 对于大部分培养液，其液相粘度相对较低，固相悬浮细胞是构成粘度的主要因素。因此， 本文提出以流变特性关联细胞生长量，为丝状菌乃至其它种类细胞生长的测量提供一条新思路。 1材料和方法 1.1菌种及培养基川 菌种:绛红小单抱菌 发酵培养基 (砂l00ml):黄豆粉3.5,淀粉4.5，葡萄糖0.1，玉米粉 1，蛋白脉0.4, KN030.02,(N氏),SO,0.1,Cocl,1x10一3，CaC030.4,PH二7.8 1.2 发酵工艺 摇瓶发酵:斜面抱子转人种子瓶35℃培养36一45小时，接人发酵瓶35℃培养120小时，摇 床转速220r/min. 1.3 流变特性浏全 选用B型粘度计 (上海天平仪器厂出产)，测量温度3790。因丝状菌发酵液有触变性}3]测 量时要严格规定剪切时间。丝状菌发酵液为典型的假塑性流体U[J剪应力与剪切速度的函数关系 为 : r二KY (1) 其中K为稠度系数，n为流动特性指数，继续对式 (1)两边分别取对数得到直线关系: log(r)二log(k)+nlog(y) (2) 经线性最小二乘法拟和求出稠度系数，相关系数均在98%以上。 .14 固含率测定，【一]， 取发醉液，生理盐水洗涤离心，加稀盐酸，生理盐水洗涤，过滤，60C烘干至恒重。 1.5 核酸贡测定Is] 取发酵液，离心，弃上清液，于沉淀中加人。5mo/lLTCA(三抓乙酸)，于。℃放置30min, 191 离心弃巨清液;再加人TCA，于0℃保温30min，离心取上清液于260nm测定吸光度。 1.6 残糖黄131 菲林试剂法 1.7 色素吸光度测黄t61 (约色素的提取:取发酵液，加人生理盐水，3000r/min下离心lomin,弃去上清液，加乙 醇，调PH至4.0，振荡，静置15min,3000r/min下离心lOmin，得到色素提取液。 (2)测量波长的选定:对色素提取液连续波长扫描，由吸收波谱图确定510nm处为最佳测量 波长 2 结果与讨论 跟踪测试理论上与生物量有相关性的参数，寻找反映丝状菌细胞生长信息的最佳生化指标。 2.1 固含率 (干重法) 细胞干重法常用于测量可溶性培养基中的细胞含量。当菌体与不溶性培养基无法分离时， 只能得到固含率，由于每瓶发酵掖仅含0.1一。2g菌体，相对不溶培养基质量 (约6g)极小，因 此很难反映菌体量的变化趋势。由图1即看出，固含率曲线无规律变化，并受瓶间差异影响随时 间上下振荡。 2.2 核酸黄 图2为发酵液F中核酸吸光度与发酵时