提高毛细管电泳灵敏度的微柱固相萃取法的研究.pdfVIP

CE一011 。提高毛细管电泳灵敏度的微柱固相萃取法研究 张普敦1熊建辉1袁凯龙1石先哲1许国旺1魏复盛2 (1中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心辽宁大连116011) (2中国环境检测总站北京100029) 毛细管电泳具有高效、快速、样品消耗量低等特点，但由于采用了细的柱内径导致其灵 敏度通常较低，限制了其应用。提高毛细管电泳灵敏度的方法有四种：选择不同的检测器、 改变检测方式、柱上样品浓缩和柱外样品浓缩；柱外浓缩技术灵活性大，处理样品量不受限 制，对组成复杂样品可以进行处理，因此特别适合复杂基体中样品的分析。本文提出一种新 SolidPhase 的柱外样品预浓缩方法—微柱囿相萃取法(MicrocohmmExtraction，MicroSPE)， 其萃取床体积小，通过手动泵的作用可完成对复杂体系的萃取浓缩，方法易于实现，易于重 现，萃取效率高。将其与毛细管电泳结合，灵敏度提高显著。 1微柱固相萃取装置 、 图1给出微柱固相萃取装置的示意图。对萃取微柱特征进行考察，表明当采用的固定相 填料粒径在40一60m之间，玻璃纤维作塞子，填充长度在2～4mm之间时，可获得合适的柱 容量和低的柱反压。 秭 图1．微柱固相萃取装置示意图． 1．手动泵；2．0．5ml注射器；3．聚四氟乙烯联结管，1．3cIn|4．萃取床；5．玻璃纤维 6．填料，2一●m；7．毛细管，1．5c‰8．聚四氟乙烯管，1．3m。 2复杂生物体液中痕量样品的微柱圃相萃取方法的建立 采用微柱固相萃取装置对生物体液中痕量样品进行浓缩时，首先必须建立样品在微柱上 的洗脱曲线。洗脱曲线的建立方法如下：固定上样体积(201)、标准样品浓度(2．0g／m1) 以及脱附溶剂体积(11)，用一系列不同体积比的甲醇／水作脱附溶剂，脱附液用电泳分析， 记录不同体积比时的信号强度即可得到洗脱曲线。根据洗脱曲线可确定样品的洗脱过程。对 复杂生物体液中的痕量样品，为消除基体对样品脱附的干扰，经常需要用弱溶剂对上样微柱 进行洗涤。完整的萃取过程包括以下几个步骤：新柱老化、上样、洗涤、脱附和柱再生。 3微柱固相萃取装置对复杂生物体液中痕量样品的浓缩纯化 3．1尿中舒林酸的浓缩纯化 尿是一类典型的复杂基体，它具有很高的盐浓度，高的蛋白含量，另外在尿中还存在大 量的代谢产物，这些都干扰分析物的测定。舒林酸是一种较新的非甾体类抗炎药，它经口服 后在体内代谢，从尿中排出。研究尿中的舒林酸含量有可能提供评估这种药物的安全性、治 疗效果以及作用机理方面的信息。采用毛细管电泳对其分析时，必须对尿样进行处理。采用 微柱固相萃取装置对尿中的舒林酸可以进行有效的浓缩，并能对基体纯化。根据舒林酸的洗 1 脱曲线，我们选用的脱附条件为：先用3 15／85甲醇／水洗涤，再用70／30甲醇／水脱附。 图2是尿中舒林酸经微柱固相萃取后的电泳图。采用内标法定量，舒林酸的检测限达到2．9 ng／ml，与正常电泳方式相比，灵敏度提高262倍。 3．2血浆中维甲酸异构体的浓缩纯化 血是另一类典型的复杂基体，它具有与尿基体相似的特性，而且在血浆中蛋白的含量更 高。因此对血浆中的痕量物质分析时，样品必须预处理。维生素A在体内代谢可产生一些极 性化合物，其中13-顺一和全反式一维甲酸是十分重要的两种物质。用毛细管电泳分析维甲酸 异构体的文献很少．而且均未对血浆样品进行分析。根据维甲酸的洗脱曲线，采用纯甲醇作 为脱附溶剂。另外由于其疏水性很强，脱附溶剂的甲醇／水比例小于60／40(v／v)时，样品 不能被洗脱，因此可用小于50／50的甲醇／水做洗涤溶剂，或将样品溶于具有一定甲醇含量 (小于50／50)的溶剂中，从而可省去洗涤步骤。图3是血浆中维甲酸异构体经微柱固相萃 取后的电泳图。血浆的处理方法为：取0．5m12．0 g／ml维甲酸加标血浆，加入等体积甲 醇，振荡离心，上清液用甲醇／水定容到1m1，此时相对于加标血浆，其浓度减少一半，即 理论上应为1．0g／ml。与正常电泳方式相比，其灵敏度提高100倍以上。 删 ∞ ∞ m ∞ 0