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印染废水中活的但非可培养状态细菌的发现 　　摘 要：【目的】探明印染废水生物反应器中活的非可培养（viable but non-culturable，VBNC）细菌及其系统关系。【方法】利用土质滤材构建生物反应器，基于复苏促进因子（resuscitation promoting factor，Rpf） 对VBNC细菌的复苏刺激生长作用，采用最大可能数法（most probable number，MPN）及其MPN培养系判断样品中的细菌总数，稀释平板法分离其中复苏可培养化的VBNC菌株，解析16S rRNA基因系统关系。【结果】（1）MPN培养系中，处理组MPN值对应的细菌总数为9.3×106～2.4×108，大于对照组MPN值对应的细菌总数4.3×106～9.3×106，表明添加Rpf后可培养化细菌总数最高从每g样品的7.5×106提高到2.4×108；（2）添加Rpf可使样品中细菌分离丰度提高2.2～32倍，表明印染废水生物反应器中存在对Rpf敏感、复苏可培养化的VBNC优势菌群；（3）MPN培养系中处理组稀释段培养液的OD660值大于对照组的OD660值，表明Rpf对部分细菌菌种有生长刺激作用。【结论】利用复苏促进因子Rpf，探明了印染废水生物反应器中存在对Rpf敏感的VBNC菌种，包括放线菌、革兰氏阳性以及革兰氏阴性菌。本研究结果揭示了印染废水中存在大量活的但非可培养状态细菌，这将为其形成机理、复苏活性化机制以及印染废水深度处理工程工艺改进等方面的深入研究提供重要的思路与方法。 　　关键词：印染废水 生物反应器 VBNC菌 Rpf 16S rRNA基因序列系统关系 　　中图分类号：X703 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）07（b）-0103-02 　　全球每年都会排放大量的印染废水，因其成分复杂，碱度、有机物含量、色度以及化学需氧量高，生化降解性相对较低，排放量大、水质变动范围广，属难处理的工业废水。大量难降解染料的过量使用及排放已造成严重的环境污染，某些毒性物质对人类健康构成严重威胁，印染废水的深度处理已经引起社会广泛关注，而其中高效微生物处理技术的开发已经成为行业令人瞩目的研究热点。 　　利用传统的纯培养技术从土壤、活性污泥、海水、湖水、沉淀物以及城市污水处理系统等环境中能分离培养的微生物只占总数的0.01%～10%，其他的为未培养（uncultivated microorganisms） 或为活的但非可培养（viable but nonculturable， VBNC），表明多种生态环境中绝大部分微生物尚处于未知状态。 　　自从1982年Xu等人首次在环境中发现生存但不可培养的霍乱弧菌和大肠杆菌后，至今国内外已有大量文献报道了VBNC菌的相关内容。细菌由于多种因素导致进入VBNC状态，该类微生物在不良环境条件下具有生物活性，用常规培养法无法检出，但在一定条件下可以复苏并保存原有功能的一种特殊生理状态。尽管VBNC菌处于低代谢状态，但1998年Mukamolova等报道了藤黄微球菌 Micrococcus luteus在对数期后期分泌的一种蛋白质能使该菌以及近缘的分枝杆菌Mycobacterium属的一些处于VBNC状态的细胞复苏成为可培养化，这种蛋白质被命名为复苏促进因子Rpf（resuscitation promoting factor）。已有研究表明Rpf能复苏刺激大量革兰氏阳性菌的生长，包括Mycobacterium， Rhodococcus，Arthrobacter， Leifsonia，Bacillus， Nocardia， Kitasatospora，Streptomyces 和Paenibacillus属的细菌。丁等研究表明Rpf对难培养微好氧贫营养革兰氏阴性菌Curvibacter fontanus具有良好的促进生长的功能。 　　该文介绍利用复苏促进因子Rpf蛋白信号分子对VBNC细菌的复苏刺激生长作用，在设计的MPN培养系中，通过计数MPN值换算获得样品细菌总数，验证Rpf对VBNC菌种的复苏促进作用，从印染废水处理系统中分离处于VBNC状态菌群、解析其组成与16S rRNA基因系统进化关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 Rpf的制备 　　实验菌种藤黄微球菌Micrococcus luteus IAM 14879（=NCIMB 13267）由东京大学分子细胞生物学研究所国际菌种保藏中心提供。依据介绍的方法制备M. luteus的DNA，确定rpf基因引物进行PCR 扩增，利用pET15b质粒载体并转化大肠杆菌DE3 表达，以SDS检验获取纯化重组蛋白。rpf基因阳性菌（MpET15brpf-P）在LB培养基（Tryptone