新型硅基弱阳离子交换剂地研究.pdfVIP

LC-114 新型硅基弱阳离子交换剂的研究 左雄军 李 静 魏 文 (中国科学院广州化学研究所，广州510650) 离子交换色谱法是蛋白质分离非常有效的手段，在生命科学中应用极为广泛。其中，弱阳离 子交换色谱法在碱性蛋白质的分离中发挥着重要的作用。常用的弱阳离子交换剂有树脂型和硅基 型两类，因硅胶型弱阳离子交换剂溶胀性小、机械强度大、不变型、不收缩、柱渗透性好，适宜 用作碱性蛋白质的快速分离P[I。但键合相弱阳离子交换剂不耐酸、碱、盐的腐蚀，用作碱性蛋白 质分离时，柱效损失快，柱寿命短[21。而且因键合量所限，固定相表面硅轻基对碱性蛋白质造成 不可逆吸附，峰拖尾或不出峰。不少文献用吸附聚合物法制备硅基弱阳离子交换剂以解决不可逆 吸附等问题[3-71，但吸附的亲水性聚合物在缓冲液中易流失。本工作用层聚胺基固定相与马来酸醉 反应，制备硅基弱阳离子交换剂，并用该弱阳离子交换剂分离碱性蛋白质。 1 实验部分 1.1仪器和试剂 LC-6AHPLC系统 (日本岛津)，254nm检测。 马来酸醉 (分析纯)，乙酸配 (分析纯)，硅基层聚胺基固定相 ((511um)由本实验室自制: 标准蛋白质核糖核酸酶A、细胞色素C和溶菌酶购自上海生化试剂公司;三狂甲基胺基甲烷 (丁ris, 分析纯)。 固定相制备:5g硅基层聚胺基固定相和2.5g马来酸配分散于25mL甲苯中，加热反应6h,再 以2.5mL乙酸配钝化2h,即制得硅基弱阳离子交换剂。 1.2柱填充 固定相在73.5MPa压力下装填至100X4二不锈钢柱管内。 2 结果和讨论 2.1 固定相的元紊分析 该固定相除基质硅小球外，有机化合物含C,H,N和O等4种元素，用元素分析仪可测定C, H,N含量，分别为C:17.4%,N:3.20%,H:2.70%,固定相有机物含量大，基质硅小球在酸、碱、 盐环境中较稳定。固定相的稳定性主要由一NH-CO-键的稳定性制约。使用的盐浓度可高达 1.5mol/L,pH值范围在1^-10之间，固定相有较好的稳定性。 2.2梯度条件对碱性蛋白质分离的影响 以25mmoVL,pH5.5的三轻甲基胺基甲烷作起始缓冲液，0.5mo/lLNaCl和25mmo/lL三轻甲基 胺基甲烷 (pH6.0)作梯度终止缓冲液，考察线性梯度变化时间对细胞色素C、核糖核酸酶A、和 溶菌酶保留值的影响。结果表明，保留时间随梯度变化时间递减而线性递减。 2.3缓冲液pH值对分离的影响 以和2.2节相同的缓冲液浓度，在州 4至9之间改变起始缓冲液的pH值，在30min线性梯 度洗脱条件下，起始缓冲液pH值增加，3种碱性标准蛋白质表面电荷数减少，保留时间线性递减。 2.4 色谱分离 选用2.2节的缓冲液条件和30min线性梯度洗脱，标准蛋白质核糖核酸酶A，细胞色素C和 溶菌酶不仅分离度大，分离时间短，而且峰型对称，以峰高的十分之一处的峰宽值测定不对称因 子，结果在0.90到1.05之间，近于高斯分布。 2.5鸡蛋蛋清中溶菌酶的分离 鸡蛋蛋清中不仅含有丰富的鸡蛋白蛋白等酸性和中性蛋白质，也含有较大量的碱性溶菌酶。 用2.3节的条件洗脱，可使酸性蛋白质和中性蛋白质保留较弱或不保留，而溶菌酶保留很强。经 该柱分离，一次性可从鸡蛋蛋清中得到高纯度的溶菌酶。由此可见，该柱在实际样品分离中具有 很好的适应性。 3 结论 调整洗脱条件可使碱性蛋白质在弱阳离子交换柱上得到理想的分离。以层聚法合成的硅基弱 阳离子交换剂克服了键合硅基离子交换剂对碱性蛋白质不可逆吸附的不足，且提高了固定相耐酸、 碱、盐的缓定性，故在碱性蛋白质分析和制备分离中极具开发应用的潜力。 参 考 文 献 IYamamotoS,NakanishiR,MatsuoR.lonExchangeChromatographyofProteins.NewYorkM:arcelDekker,Inc.1988 2Engelhardt托CzokM,SchultzRetalJChromatogr,1988,458:79 3ChangSH,GoodingK从RegnierFE,J