中性鞘磷脂酶的抑制剂N-1530A地研究.pdfVIP

Tn细胞．3d后收集细胞进行SDS—PAGE和Westernblot分析。结果表明，EC—SOD基因在昆虫杆状病毒 blot分析表明(图略)，SDS—PAGE图谱中 质量约为28000，与理论分子量相符。用抗His抗体进行Western 显示的28000左右的条带确为EC—SOD。 胞，用邻苯三酚自氧化法测定具有SOD酶活性，以不含重组EC—SOD基因的空扦状病毒为阴性对照，则表 达产物的酶活力为260u／mg总蛋白。 4讨论 昆虫杆状病毒表达系统作为一种真核表达系统具有蛋白质加工、折叠和修饰等过程，所以其表达的蛋白 质基本上与其天然蛋白质的结构相似。为了得到大量蛋白质，进行蛋白质的理化性质研究、生物学功能研究 等工作时，昆虫杆状病毒表达系统是一种比较常用的表达系统。昆虫杆状病毒表达系统除具有以上特点外， to 还有一十显著的特点，就是具有较高的表达量。BacBac昆虫杆状病毒表达系统采用转座方法，将昆虫杆 状病毒的同潦重组转移到大肠杆菌体内进行，并采用蓝白斑筛选方法，操作简单安全，而且可以节约时间。 实验结果表明，我们经过BactOBac昆虫杆状病毒表达系统将EC—SOD基因转移到昆虫杆状病毒中， 在多角体启动子的控制下，在Tn细胞中得到了大量的表达。表达产物为可溶性蛋白，有利于分离纯化；另 酶切除，利于对其N端功能的研究。据报道EC—SOD的N端为形成其正确的四聚体结构所必需。 EC—SOD舶c端肝素结合区的活性调控可以通过部分蛋白的酶解实现，其将导致EC—S00在胞外基 质和胞外流体中的分布，其生物学意义和具体机制还不完全清楚。我们构建的EC—SOD基因杆状病毒昆 虫表达系统将为以后其活性位点、糖基化位点以及肝素结合位点等的突变和缺失研究提供基础，进一步研究 Lateral Cu，Zn—SOD的突变一样可能导致家族性肌肉萎缩旁侧硬化(Familiar Sclerosis，FALs) Amyotrophie 的研究等具有重要的意义。(参考文献略) 中性鞘磷脂酶的抑制剂N—1530A的研究 董悦生1 供田洋2 内田龙儿2 大村智2 (1华北制药案目新药研究开发中心石家庄050015；2日本国东京都北里研究所东京 108—8642) 信号转导是胞内通讯的辩素以及外界环境因子作用于细胞表面(或胞内受体)后，跨膜传递形成胞内第 二信使，以及其后的信息分子级联传递、诱导基因表达和引起生理反应的过程。由双层脂质膜组成的生物 膜，是由磷酯和蛋白质构成的。在这些磷脂中含有以N一脂酰鞘氨醇(Cetmide)为基本骨架的鞘磷脂 受体的刺激下，使SM分解后产生的Ceramide目前被认为是细胞内信号传递的第二信使，而愈来愈受到人 们的重视。本实验建立筛选SMase抑制荆的筛选方法，以3H标记的SM为反应底物，使用中性或酸性 SMase加水分解生成3H SMase抑制剂的能力。获得数株具有产生此种抑制剂的菌株，本文报道N一1530的发酵、分离、纯化、结构 鉴定和对中性SMase的生物活性。 1材料殛方法 1．1试剂及仪器 化学购人。 962 仪：XL一400(400MHZ)(Varian)o 1．2 SMa∞抑制活性测定 1．2．1中性SM8*活性测定方法 20}tl，SMase酶液待测样品10Ⅱ(50％甲醇溶解)及底物SM 相同。 1．2．2抑制率的计算：未加样品的酶反应的放射活性为A，掭加样品后的放射活性为B，未加入酶的情况下 放射活性为c，抑制率按照以下方法计算： [1一(B—c)]／(A—C)×100=抑制率(％) i．3培养 7H，∞．05％，KCl 0．03％，pH6．5)于27℃振摇培养6d。 1．4分离提取 物质1．89。 为100％CH3CN洗脱。测定各管活性后，收集合并活性成分，浓缩抽干后得黄色固体29．5mg。 ODS@20mmX c8 取上述活性物质29mg使用ODS