用电镜图像计数法探究细胞生长曲线.pdfVIP

电子显微学报JChinElectrMictosc．Soc 2001年 20(4)：519—520 519 用电镜图像计数法研究细胞生长曲线 邵曼君，姜蕾，李竹川 (中国科学院化工冶金研究所多相反应开放实验室，北京100080) 贴壁依赖型动物细胞已被应用于生产许多生物制品，非洲绿猴的肾上皮细胞——vero细胞 是其中最常用的一种。在细胞的微载体贴壁生长过程中有三个主要阶段：细胞在微载体上的贴 附阶段、细胞的分裂增殖阶段和后期受贴壁空间限制的缓慢生长阶段。在细胞生长过程中细胞 密度随时间的变化曲线(又称生长曲线)非常好地描述了这三个阶段，因而许多学者的研究都涉 及到生长曲线，例如通过它研究细胞培养的环境条件和空间条件对各阶段的生长速率的影响，这 一问题不但与细胞的生长动力学研究有关，而且与生物反应器的设计有关。 在以往的研究中，测量培养液中细胞密度的传统方法是结晶紫细胞核计数法。J，先将结晶紫 溶液加入微载体细胞悬浮液中，让贴附在微载体上的细胞被消化，掉人溶液并被染色，然后在倒 置显微镜下用血球计数板计数。当然，测得的数据是每单位体积细胞悬浮液中的细胞个数—— 细胞密度，即这一细胞悬浮液中的统计数据。 本研究使用KYKY一1660环境扫描电镜观察细胞在微载体上的生长过程和形态变化，具体的 制样方法请参阅文献[2]。在我们所采用的环境扫描电镜中，可以直接观察不导电的生物样品 (免除了繁琐的常规生物样品的制备)，配备了特殊的生物样品台，能把含水的细胞和微载体直接 送人电镜，并能在较短时间(1～2min)内获得电镜图像，同时连机的图像系统又能把电镜图像迅 速地储存在计算机内，这样简单的操作方法为电镜图像计数法创造了条件。计数的方法很简单， 在电镜图像中任意选取20个微载体，数出微载体观察面上的细胞数目，乘2再取平均，得到每个 微载体上的细胞数目，经单位换算后，可以得到每单位体积培养液中的细胞密度(个eellJcm3)。 这是一个统计结果，所以以上的方法也可以称为统计计数法。 3微载体 实验所用的主要材料：Veto细胞(从卫生部北京生物制品研究所获得)、Cytodex 化的搅拌瓶培养器和方瓶培养器。 首先，为了验证电镜图像计数法的正确性，进行了对比实验。在常规培养条件下．分别在接 种后8、24、48、72、96h取样，用环境扫描电镜观察，获得的图像(部分)如图la、lb、1c、Id所示。同 时，分别用电镜图像计数法和结晶紫细胞核计数法计数，得到的结果绘于图2中。从图中可看 出，这两种方法的结果很接近，说明电镜图像计数法的结果是正确的。应该指出的是，在细胞生 长的后期，也就是当细胞在微载体上即将铺满时，由于细胞都挤在一起(图ld)，很难分辨，计数 就十分困难，统计的误差就会较大。建议此时的细胞密度应用结晶紫细胞核计数法来测定。根 据不同时间的细胞密度数据可以得到细胞的生长曲线。 本文研究了细胞接种密度、培养液中血清浓度、培养液中葡萄糖浓度等培养条件对生长的影 响，图3是不同血清浓度(5％、10％)的生长曲线，从图中可以看出，血清浓度的增加较大地影响 了细胞的生长曲线，特别是在生长的初期，生长加快，使整个生长过程中，细胞密度都比血清浓度 低的培养液中的细胞密度高。对不同生长阶段保持不同血清浓度的详细研究中可知：血清浓度 对细胞的贴附影响较大，随着血清浓度的增大，细胞的贴附率增加，从而直接影响了整个生长过 电子显徽学报 J Chin．EJec口．M_cr0soc． 520 2001￡ 20(4)：519～520 程。由于文章的篇幅限制，具体内容请参阅文献13]。 图1．Vem细胞在Cyto