以蛋白质为固定相的手性液相色谱地研究.pdfVIP

LC．021 以蛋白质为固定相的手性液相色谱的研究 张强邹汉法杨利 (中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心大连116011) 1前言 手性色谱作为色谱发展的一个重要方向越来越受到人们的重视。手性液相色谱由于既 可以用于分析又可以用于制各，因而具有更广泛的发展前景．目前已成为拆分对映体的最 有效的方法。根据所键合手性选择剂性质的差别，手性液相色谱又可分为蛋白型、多糖型、 聚合物型、Pirkle型等几种类型”1。其中咀蛋白质为固定相的手性液相色谱可供选择的蛋 白种类多、使用面较广、作用机理复杂。迄今关于这方面的研究综述已有一些，但绝大多 数着重于应用。本文将从介质的选择到键合方法的确定作一阐述。 2介质的选择 最初，蛋白被键台在琼脂糖上制成了手性色谱分离固定相“。但由于琼脂糖在压力下 容易产生不可逆形变，所以这种介质只能用于早期的低压色谱。1983年AlleIlIIlark首次 把牛血清白蛋白(BSA)键合于硅胶上成功地拆分了氨基酸类消旋体。现在硅胶仍然是人们 的首选介质，因为它具有耐压、容量大、表面易活化、制各工艺成熟等优点，所以已商品 化的蛋白柱都以硅胶为介质。然而随着制药行业的发展以手性色谱制备构型单～的对映体 已成为必然趋势。选择一种处理量大、价格相对便宜的介质具有实际的意义。膜色谱具有 处理量大的优点且价格便宜，在亲和色谱中得到了广泛应用。根据膜的最初来源可分为天 然膜和合成膜两类。天然膜主要指纤维素及其改性膜，合成膜指一些高分子聚合物膜。关 于膜色谱拆分手性化合物已有文献记载”，但阻碍手性膜色谱发展的主要障碍是其键合容 量小，膜的表面性质不易控制，从而使小分子的分离尤其是手性拆分很难实现。90年代 初国际上出现了一种将聚合物单体在色谱柱内直接聚合制备液相色谱固定相的方法，此种 色谱被称为连续床层色谱。聚合物做固定相可以适用于pHl～14范围内，另外柱内聚合 死体积小、介质均匀，因此柱效很高。仔细选择单体、控制聚合条件可以以此为载体制成 蛋白柱用于手性拆分”1。鉴于每一种单一介质总存在一些缺点，又出现了复台介质。如由 于聚合物往往是疏水的．在其表面键合一层亲水聚合物使其可用于蛋白的键合；硅胶不能 用于强碱性环境，可在其表面覆盖一层聚合物等。 3蛋白的选择 白蛋白是最早用于手性拆分的蛋白质。这是因为在1973年以前就已知BsA对色氨酸 对映体具有不同的亲合力。目前人血清白蛋白(HsA)也广泛用于手性拆分。由于此类蛋白 质来源丰富、易于纯化且与很多药物有不同的作用，所以一直是最常用的蛋白。人们已经 成功地用此类蛋白拆分了许多对映体，并摸索到了一些拆分的规律，但其拆分机理仍然不 清楚。另外这一类固定相液相色谱还可用于研究药物与蛋白的相互作用。酸性蛋白是另一 ．64． 类用于手性化合物拆分的蛋白质，其中a．酸性糖蛋白(AGP)是最常用的一种，由于此类 蛋白分子含有糖基，所以其链合方法更加灵活。Hemallsson”，己对它的拆分作用做了系统 的研究。与白蛋白不同的是离子对的加入对手性拆分有很大的影响。卵类粘蛋白也是一种 糖蛋白．实验发现糖基的存在与否至关重要，一旦糖基丢失，手性拆分能力即丧失。这说 明糖具有对映体识别能力。卵白素是从鸡蛋清中提取的抗生物素蛋白，最近己被固载于硅 胶上用于手性拆分。结果证明对布珞芬类药物有很好的手性拆分能力”1。除了以上蛋白外， 一些酶也可用于手性色谱固定相，如纤维素生物降解酶、靡蛋白酶(AcHT)等。由于每种 蛋白适用于不同的手性化合物，所以应用中要根据拆分对象的特点进行筛选。虽然不同物 质在蛋白柱上拆分机理尚未清楚，但还是有一些规律可以遵循：(1)流动相有脂肪醇的加 入往往使对映体的保留值减小，这是因为减小了对映体与固定相间的疏水作用。(2)pH 值的变化对带电荷对映体在色谱柱上保留值的影响远比对不带电荷对映体的保留值的影响 大。(3)流动相中添加剂的加入可产生不同的影响，如与要拆分的对映体在蛋白上的作用 点相同则会因竞争作用减小其保留，否则将产生别构作用使对映体的保留值难以预测。(4) 由于对映体与蛋白分子作用的复杂和蛋白表面上存在多个作用点，使得不同对映体在同一 蛋白柱上的保留值差别很大． 4蛋白的键合方法 固载蛋白的技术由来已久。具体选哪一种主要根据实验室的实际情况来定。本文先以 最常用的氯丙基硅胶为载体阐述各种键台方法。戊二醛(GA)法：这是一种最常见的方法， 反应条件温和而且在不同pH值下