11第11章.ppt

第十一章 分子生物学技术的临床应用 上海交通大学 樊绮诗 四川大学 范 红 第一节 标本来源 DNA或RNA 来自外周血、体液、分泌物和组织 如毛发、皮肤、肌肉、器官、肿瘤组织等 产前基因诊断标本： 　 羊水细胞 （16周～20周） 　 绒毛膜细胞 （7周～9周） 第二节 分子生物学技术在病原生物基 因组相关疾病研究和诊断中的应用 一、感染性疾病的诊断和治疗监测 分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要包括对病原生物进行鉴定、分型、耐药诊断和治疗过程中的疗效监测等 检测核酸分子或蛋白质分子 目前已经应用于一些重要的感染性疾病，如结核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等 （一）结核分枝杆菌 1.生物学特性与致病性 结核分枝杆菌复合群包括人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，其中前三者对人类致病 人型结核分枝杆菌感染的发病率最高 一、感染性疾病的诊断和治疗监测 结核分枝杆菌生长缓慢，增殖一代需15～20小时，生长成可见菌落一般需4～6周 在组织细胞内大量繁殖引起炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及菌体成分诱发的机体免疫损伤 一、感染性疾病的诊断和治疗监测 2.基因组特点 共价封闭环状结构 标准株结核分枝杆菌基因组全长4.4kb,包含4000个蛋白质编码基因和50个RNA编码基因 一、感染性疾病的诊断和治疗监测 (1)重复序列：如IS6110，仅存于结核分枝杆菌复合群细菌染色体上长1355bp的重复插入序列，具有复合群特异性 (2)蛋白质编码基因 (3)rRNA基因：每个细胞约含有103～104 个rRNA，含有结核分枝杆菌高度保守的序列，也有分枝杆菌种特异性序列 一、感染性疾病的诊断和治疗监测 3.结核分枝杆菌核酸的检测 实验室检查手段主要包括标本直接涂片染色镜检、分离培养鉴定以及血清学抗原检测方法 分子生物学理论和技术已经用于分枝杆菌的分子结构和功能的研究中，并开始用于临床菌种和耐药株的鉴定及监测 一、感染性疾病的诊断和治疗监测 PCR菌种鉴定法 PCR直接测序鉴定法 PCR-DNA探针鉴定法 PCR-基因芯片法 一、感染性疾病的诊断和治疗监测 (2)药物敏感性试验与耐药基因检测： 缩短培养和鉴定的时间，及时指导临床选药 药物敏感性试验 直接检测耐药基因 1.生物学特性及致病性 HBV对外界环境的抵抗力较强，且传染性较强 输血或注射是重要的传播途径 HBV感染后潜伏期约2～6个月，HBV DNA在肝细胞内以游离DNA和整合到宿主细胞染色体的方式存在 HBV分为8个基因型，A～H型 2.乙型肝炎病毒核酸的检测  （1）荧光定量PCR技术：测定HBV病毒载量 HBV DNA ?107拷贝/毫升，提示病毒复制活跃 HBV DNA 103拷贝/毫升、HBeAg转为阴性，ALT 正常的病人预后相对较好 （2）支链DNA（bDNA）技术： 一种核酸探针杂交标志信号放大技术 。 优点：稳定性和重复性较好，结果准确，操作简单， 将待测病毒裂解释放核酸后变性为单链，即 可进行检测 。 缺点：敏感性较低、检测范围窄而不适用于低水平病 毒的检测 。 3.变异株与耐药突变检测 HBV可能发生自然变异 HBV在人体活疫苗接种和抗病毒治疗等压力下发生变异 HBV基因组的变异常引起病毒生物学特性的改变，从而导致HBV感染发病机制的变化、血清学检测指标的改变以及免疫逃逸，给乙型肝炎的诊断和治疗带来困难 1.形态结构与致病性 HIV根据血清学反应和病毒核酸序列分为 HIV-1型、HIV-2型 HIV结构分为 包膜、核心 HIV直接或间接损伤CD4+T细胞 HIV抑制抗原递呈细胞功能 HIV诱发自身免疫性疾病及诱导细胞凋亡 HIV导致CD8+T细胞丧失抗病毒活性等 原位杂交 PCR NASBA技术 bDNA技术 荧光定量RT-PCR技术 （四）SARS冠状病毒 从SARS病人体内分离到的冠状病毒与任何以往确定特征的冠状病毒关系不密切，且该病毒的有限区域的复制酶（rep）基因序列与其它冠状病毒明显不同，因而被称为SARS相关冠状病毒。 SARS相关冠状病毒的检测 WHO推荐SARS-CoV特异性检测方法： 分子生物学检测 免疫学检测 细胞分离培养 一、感染性疾病的诊断和治疗监测 免疫学方法难以在感染的窗口期对病毒感染进行早期检测 细胞培养所需时间较