鸡IL-18基因变构体毕赤酵母表达载体的构建与分泌表达.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第四届第九次学术研讨会论文集(下册)(2008年河南新乡) 鸡IL．18基因变构体毕赤酵母表达载体的构建及分泌表达 刘一尘1’2张春杰2‘程安春1程相朝2汪铭书1李银聚2吴庭才2易明林3 河南洛阳 (1．四川农业大学动物科技学院，四川雅安625014；2．河南科技大学动物科技学院， 471003；3．河南省农作物新品种重点实验室，河南郑州450002) 在增强免疫、抗微生物感染、抗肿瘤等方面有着广阔的应用前景． 首次获得ChlL．18eDNA，此后潘蔚绮等，刘胜旺等和温纳相等分别得到了不同品种鸡的ChIL．18成熟 蛋白基因。但目前ChlL-18的克隆表达研究仅在原核表达系统中有一定的进展，在毕赤酵母表述系统中 的表达目前国内外尚未见有关报道．本研究通过对MchIL．18成熟蛋白基因进行定点突变，把毕赤酵 步研究ChIL．18的生物学特性奠定良好的基础。 1．材料和方法 Pastoris 兽医实验室构建保存；Pichia X．33及其表达载体pPICZaA由南京农业大学陈傅言教授赠送。 PCR检测引物P1、P2由大连宝生物公司合成。 AOXl Pl(3 sequencing P2(ct-Factor primer)：5-TACTAlvI’GCCAGCA下I’GCTGC一3’ sequencing 1．2血清兔抗鸡IL。18多克隆抗体由河南科技大学预防兽医实验室制各。 DNA 1．3主要试剂EcoRI、KpnI、SacI等限制性内切酶、T,DNA连接酶、Taq Polymerase、 公司；胰蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、琼脂、山梨醇、生物素、YNB等购自OXOID公司；羊抗 兔辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG抗体，购自北京赛百盛基因技术有限公司；普通琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒购于北京天根生化科技。 1．4变构基因的获得及克隆载体的构建 1．4．1 MChIL-18基因中密码子的突变采用反向长距离PCRIrl,根据毕赤酵母密码予偏好性、IL-18 上游引物P3： 下游引物P4：5’．G1℃AAlrAGccAGrrGCTTGTGGTT．3’ J 使用说明进行反向长距离PCR，反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳检测并切下目的条带用北京天根生 化科技普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。 1．4．2变构基因克隆载体的构建及鉴定对纯化的PCR产物进行平端化Ⅸ应，按适当的反应体系37C反 1／10体积的3M 8．T-MChILl 1．5重组质粒pPICZaA—MChIll8。的构建pMDI I 双酶切，电泳后按北京天根生物科技有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的方法回收纯化 MChlLl8。／EeoR I／Kpn I和pPICZaA／EeoRI／Kpn I双酶切产物，进行16C过夜连接。转化大肠杆菌 JMl09感受态细胞，提取质粒，进行PCR、双酶切鉴定和测序，将获得的重组质粒命名为 359