铁还原酶基因转化苹果地研究.pdfVIP

铁还原酶基因转化苹果的研究 刘艳军’杨静慧 杨恩芹 刘玉冬 柳树梧 (天津农学院园艺系天津300384) 摘要为进一步提高苹果一八楞海棠的基因转化率，本研究用八楞海棠试管苗的不同组织部位 (叶片、叶柄、节间茎段、破坏生长点的茎尖)为外植体，在含有0，1，3，5，10mg／L浓度除草 3mg／L的除草剂浓度为适宜的筛选压力；在此筛选压力下，以八楞海棠不同外植体进行基因转化， 其中破坏了生长点的茎尖处理组获得的转化率最高，通过对部分除草剂筛选的转化苗进行的PCR及 Southern杂交检测，均鉴定为转基因苗。 关键词八楞海棠遗传转化外植体筛选压力 苹果是重要的落叶果树，其童期长，自交不亲合，杂合程度高，难于离体再生。因此，基因转 移技术获得转基因植株已逐渐成为苹果育种的重要手段。通常苹果的基因转化率很低(0．】％、0．5 ％)。所以，提高苹果基因的转化率非常重要。 1．方法 取含有铁还原酶基因FRO。和pCB302表达载体的工程菌种单菌落，接种到LB液体培养基中，待 其0D值为0．4时，取出浸染外植体，然后将外植体放在带有滤纸的MS固体培养基上，在28。C和黑 (t／2MS+IBAO．5mg／L)。外植体分别为八楞海棠试管苗的叶片、叶柄、节间、破坏生长点的茎尖。 待苗长到3cm高时随机选取4株进行PCR和Southern blot检测，所用探针为800bp的35S启动子 dCTPIO～20It 基因片段，探针标记采用随机引物法P32 Ci放射标记。 2．结果与分析 2．1除草剂筛选浓度的确定和植株的再生 。电话：022电子邮箱：dhtjac@public．tpt．tj．cn 26 当除草剂浓度为lmg／L时，基本不影响外植体的再生率，而浓度达到3mg／L时，所有外植体都 不能再生，而逐渐死亡。不同处理再生率有显著的差别，其中以破坏生长点的茎尖为外植体的再生 2．2不同外植体与基因转化率的关系 在用除草剂进行筛选时，不同部位的苹果外植体的FR02基因转化率有明显差异，其中用破坏 生长点的茎尖为外植体进行的转化，转化率最高，达10．8％；而叶片的最低。 从诱导的过程看，在接种初期(7d)，所有外植体都无明显差异。14’21d后，大部分叶片开始 变黄，少数叶片的伤口部位有白色愈伤组织长出；叶柄的变黄数量较叶片组略少，但愈伤多出现在 叶柄与茎连接一端，且多为绿色或淡绿色，而另一端很少见到；节间茎段处理组，多数两端先失绿， 后全部变黄，而少数保持绿色的也在其两端长出白色愈伤组织；破坏生长点的茎尖处理组，变黄的 外植体最少，愈伤也都为绿色，并有个别转化芽分化出来。28d后，大部分没有再生芽或愈伤的外 植体都基本变黄、变黑至死亡。其中绿色愈伤组织才能再生出芽。 2．3PCR及SouthernBlot检测 4株转化苗经PCR及Southern Blot检测。4株转化苗在2178bp处均有一条特异扩增的电泳带， 并都有很强的杂交信号，表明外源基因已经整合到八楞海棠基因组中。 27