牛胎盘间充质干细胞体外分离培养与生物学特性研究.pdfVIP

ANIMAL 2012，VOLUMEl3，NO．1BIOTECHNOLOGYBULLETIN 147 牛胎盘问充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究 武坤，陆涛峰，李向臣，关伟军‘，马月辉’ (中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京市海淀区圆明园西路2号，100193) 引言 再生医学是一个新兴的多学科领域，致力于修复因疾病或外伤 官功能。干细胞因其所具有的全能性，成为再生医学领域不可多得 手段，但在干细胞还存诸如高致癌性、病毒感染威胁及伦理方面的 约了其在再生医学领域的应用。经过不断研究探索，发现胎盘组织 全新的干细胞组织来源。胎盘间充质干细胞因具有来源广、免疫原 冲突的优点，成为现今临床医学中理想的干细胞保存及利用资源。 Stem 养了牛胎盘问充质干细胞(Placenta Cells，PMSC Mesenchymal 造的问能性本，治 学特性进行了检测，为牛胎盘来源干细胞研究奠定基础，并为临床 成治题够低研并疗 的疗，作及究对提 组材大为无分其供 织料大一伦离生参 器和制种理培物考 借鉴。 材料方法 本研究从妊娠3．4月的子宫内剪取子叶绒毛，10／oIV型胶原酶消化30min，分离 得到间充质干细胞，使用含有15％血清的L．DMEM培养基对分离得到的细胞进行 体外培养。使用免疫组化、RT-PCR方法对牛PMSC表面特异性分子标记CD29、 CD44等进行检测。从细胞生长曲线、指数生长期细胞周期及单克隆形成能力三 个方面对所培养细胞进行增殖能力检测。诱导牛PMSC向脂肪细胞及成骨细胞进 行分化，并进行细胞及分子水平检测。 ’ 结果与讨论 1、分离培养：通过本实验方法所得到的牛PMSC呈现多角形，形态均一。牛 子叶绒毛主要来源于体壁中胚层和滋养外胚层，相比牛胎盘其它来源，分离得到 的细胞纯度更好，纯化更方便。到目前为止传代至P30，体外培养时间超过100 天，总计冻存189支。 2、表面分子标记检测：免疫组化和RT-PCR检测表明所培养牛PMSC表达间 造血干细胞特异性标记基因CDl06、CD45、CD34和BLA．DR均不表达。 3、增殖能力检测：对P20代细胞进行增殖能力检测。牛PMSC细胞生长经历 了潜伏期、对数生长期和平台期，生长曲线呈现典型的“S”形，群体倍增时间为 21h。检测指数生长期细胞的细胞周期状态，其中G1期细胞占66％，S期占17．5％。 单克隆形成能力为46．67％。 4、向成骨细胞诱导：诱导后5天，细胞呈现长的多边形；12天时开始出现小 的结节样结构，边缘具有较强折光性，并随诱导时间延长变大。茜素红染色可以 看到大量着红色的钙结节，同时RT-PCR结果显示成骨细胞特异性基因Collagen typeI和Osteopontin呈阳性。 5、向脂肪细胞诱导：诱导后3天，细胞呈现不规则的多边形，体积变大，折 光性增强。7天时在细胞内出现小脂滴，并随诱导时间延长而增多。油红O染色可 阳性。 结论 本研究通过对牛PMSC体外分离培养及鉴定的研究，成功获得了牛PMSC细 胞，建立了适合牛PMSC的分离培养体系，为牛干细胞研究及医学临床提供了参 考和借鉴。 关键词：牛；胎盘；干细胞 201 lZx08012—002—06)；基本科研业务项目(201 lcj一9)和国家家养动物种质资源 平台项目(2012)资助。 马月辉，男，1964年生，研究员，博导，E—mail：yuehui—ma@hotmail．tom。