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一十}m咄相关肝癌差示表达基因的克隆及功能研究 153 一个HBxAg相关肝癌差示表达基因的克隆及功能研究 刘杰胡家露樊代明丁杰吴开春朱明华 ZhaoruiLian五柚oPanMarcy MarkFeitdsan C3e,on HBV尤其是HBxAg和肝癌发病密切相关。实验研究显示，HBx不仅能体外转化鼠的肝 细胞株，而且能和p53抑癌基因结合，抑制其功能“J。进一步实验证实，在mx转基因鼠中，X 蛋白和口53形成的复合物与肿瘤的发生有一定关系[2J。此外在对岫x的研究中许多学者均 编码出的髓x蛋白具有转录激活特性及转化特性旧J。更有实验证实，船x因能改变和调节一 些转录因子的活性，通过改变信号传导途径，在转录调节水平上介导肿瘤的形成L4J。因此，我 而在基因水平上的变异，即有哪些基因被HB,,Ag启动而表达上调，又有哪些基因被rmxAg抑 差异分析(cDNA subtractive RDA)更为先进的抑制差减杂交技术(suppressmhybridization， 交，观察了两株细胞因HBx的转染而导致的基因表达差异。对有差异的其中1个基因片段， 迸一步克隆出了全长基因序列并做了初步功能分析。 材料与方法 CAT的构建 l一)逆转录病毒质粒载体psLXCMVm3V-X及pSLXCMV CAT表达栽体构建将726 1，氯霉素乙酰转移酶pSLXCM bp包台有CAT基因的Hind m—Barn HI的酶切片断，在HpaI．Bgll酶切位点装入pSLXCMV质粒。 2．HBV 并做序列鉴定。 (二)重组逆转录病毒HeI啦2细胞的感染 x10bPA317 CAT感染大约1 用磷酸钙共沉淀法将15瞎的pSLXCMV-X及pSLXCMV PA317包装细胞。过滤后的上请按照已报道的方法立即感染HepG2细胞“”。用5“富含重 作者单位：710032西安，第四军医大学西京医院消化疾病研究所(刘杰胡家露樊代明丁杰吴开鲁) Umve商ty病理及细胞生物学实验室 上簿第二军医大学病理教研室(朱明华)；黄国1脚鹧Jefferson Lhn Pan Mark (zl】aorui Jinbo Mar口O,aytonFeitelzon) 154 中国癌症研究进展⑤ t 及48 h重新加入富含病毒的培养液的上清，以最大限度地延长HepG2细胞和能够产生HBx． 细胞，经c并182周筛选后。挑选阳性克隆，正常培养液培养后，作进一步分析。 (三)抑制性eDNA差减杂交、eDNA探针克隆及铡序 者的eDNA文库；两种不同连接子分别连接被捡者cDNA，驱动者无连接子；驱动者和被检者 T Vector (Novagen)，通过转染大肠杆菌后纯化质粒DNA做序列测定，并在基因库中做比较。 l四)Northernblot分析杂交产物 甲醛变性胶电泳，观察18S和28SRNA条带，以鉴定其质量，其后将变性mRNA转移至硝酸 纤维素滤膜，P”随机引物标记法标记每一个探针(P