微生物来源的白细胞弹性蛋白酶抑制剂FO1-221A地研究.pdfVIP

微生物来源的白细胞弹性蛋白酶抑制剂F01—221A的研究 任晓郑智慧路新华刘梅董悦生林洁马瑛单越琦张华贺建功 (华北制药集团新药研究开发中心微生物药物国家工程研究中心石家庄050015) 人白细胞弹性蛋白酶(human leukocyte 解某些结缔组织成分如弹性硬蛋白，蛋白多糖和某些类型的胶原质。该酶由于炎症刺激从白细胞中 释放。它的过多表达和过高活性涉及到多种疾病的病理过程，这些疾病包括肺气肿、慢性支气管炎、 呼吸困难综合症、脓血症、。肾炎、类风湿关节炎、椎间盘退变和某些皮肤病症等[1-5]o日本学者的研 究已证实中性粒细胞弹性蛋白酶在慢性阻塞性肺疾病(COPD)的形成中起重要作用【3】。因此，弹性 蛋白酶抑制剂具有潜在的治疗上述疾病的价值。另外由于弹性蛋白酶可以破坏胶原纤维及组织基底 膜层，在肿瘤的形成和肿瘤转移方面起关键作用，所以弹性蛋白酶又成为了新的研发抗癌药物的作 用靶点‘61。 Pharmaceutical 目前国外一些大公司已竞相开展了此类药物的研发。日本的Fujisawa Co分别从 链霉菌resistomycificus和Flexibacter sp．代谢产物中分离得到了人白细胞弹性蛋白酶抑制剂FR901277 inflammatoryresponse 首个治疗伴有全身性炎症反应综合症(systemic 药物【8】。全身性炎症反应综合症大多是由严重感染、严重创伤及胰腺炎等诱发，能引起与重症炎症 或局部炎症无直接关系的肺、肝脏、肾脏等多脏器功能障碍，病情严重时造成死亡。其中中性粒细 胞及其释放的弹性蛋白酶(NE)起了重要作用。西维来司钠能选择性地抑制中性粒细胞释放弹性蛋 白酶，改善呼吸功能，缩短病人使用呼吸器的时间，降低安装呼吸器引起的压力性损伤及呼吸道感 染症的并发率，改善SIRS及特发性肺纤维化等引发的急性肺损伤。西维来司钠除了在肺部损伤和肺 部感染上的用途外，还用于急性胰腺炎、急性肾炎的临床治疗，具有广泛的市场前景，它的全球峰 值销售额有望达到10—15亿美元。在我国爆发SARS时期，西维来司钠用于治疗非典型肺炎引起的 急性肺损伤，在治疗重症患者的临床治疗方案中除了抗生素和激素以外，成为国家批准的第一个用 于临床研究的治疗非典的新药。 为了从已建立的微生物代谢产物库中筛选新的HLE抑制剂，我们建立了微量、高效的体外HLE 抑制剂筛选模型并利用鸟司他丁作为阳性对照，以验证筛选模型的可行性，灵敏度。乌司他丁‘91 的蛋白酶抑制剂，对粒细胞弹性蛋白酶、胰蛋白酶、透明质酸酶酶等多种酶有抑制作用，能够减少 组织、细胞的损伤；改善循环、改善组织灌注；抗炎、抑制过度炎症反应。利用该模型对上万株菌 株进行筛选，发现了数株阳性菌株，其中真菌F01．221具有较强的抑制活性。本文阐述了其筛选、 发酵、分离纯化、结构鉴定和生物学活性。 219 1材科与方法 1．1筛选用微生物的菌株和代谢产物 放线菌和真菌菌株及其代谢产物由本室微生物菌种库和代谢产物库提供。 1．2试剂及仪器 人白细胞弹性蛋白酶(Human Elastase， Leukocyte (N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val 2多标计数仪(美国PE p-nitroanilide)购自Sigma公司；Victor 公司)；质谱(Autospec．Ultima)500MHz核磁共振仪(Inova) 1．3HLE活性及FILE抑制剂活性测定原理及方法 测活原理与方法参考文献‘10】，底物是以化学标记的多肽-nitroanilide，反应式如下： HLE 一 多肽．nitroanilide多肽+nitroanilide u 和缓冲液共100l；对照孔用DMSO代替样品溶液；空白孔用D