siRNA+沉默hTERT+基因表达对人乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响.pdfVIP

siRNA 沉默hTERT 基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响 刘安定 董学君 杨明峰 郑 专 陈建军 浙江省绍兴市人民医院 绍兴文理学院附属第一医院分子医学中心 312000 人端粒酶逆转录酶 human telomerase reverse transcriptase, hTERT 是端粒酶的蛋白催化亚基 其表达是端粒酶 活性的限速步骤 hTERT在正常组织中几乎不表达 而绝大多数肿瘤细胞中都有高表达 hTERT mRNA 的表达与肿 瘤发生发展密切相关 RNA干扰 RNA interference, RNAi 是内源性或外源性双链RNA double stranded RNA, dsRNA 诱发的mRNA 水 平上基因沉默 具有高度特异性 哺乳动物及人类细胞中转染21 23个核苷酸的小干扰性RNA small interfering RNA, siRNA 可特异性降解靶mRNA 下调蛋白表达水平 应用RNAi抑制肿瘤细胞hTERT表达的研究有过一些报道 但干扰靶点不同 效果差异大 本研究针对3个不同干扰靶点 对乳腺癌细胞hTERT进行抑制试验 以探索能高效 抑制hTERT表达的方法 材料与方法 1 细胞株与主要试剂 人乳腺癌MCF-7细胞株为本实验室保存 LipofectamineTM 2000 Reagent转染试剂和Annexin V凋亡试剂购于Invitrogen公司 DMEM培养基 Opti-MEM培养基购于美国Gibco公司 总RNA提取试剂 Trizol 及real-time PCR试剂盒购于TaKaRa 公司 兔抗人hTERT 多克隆抗体 兔抗人β-actin单克隆抗体 HRP标记羊抗兔IgG 抗体均为Santa Cruz公司产品 ECL发光试剂为碧云天生物技术公司产品 2 siRNA 的设计与合成 根据GenBank基因已知序列 基因编号 NM_198253 按siRNA序列设计原则 应 用Ambion公司网上在线设计工具设计 并将选出的siRNA序列进行BLAST搜索 作同源性分析以保证序列的特异性 最后确定3个区段 序列分别为 siRNA1 作用位点1072-1090 5-GGAGCAGCTGCGGCCCTCC-3 siRNA2 作 用位点2003-2021 5-AAGAGGGCCGAGCGTCTCA-3 siRNA3 作用位点2663-2680 5- TGATTTCTTGTTGGT GACA-3 阴性对照siRNA4 5-GGCCTCAGCTGCGCGACGC-3 siRNA 由广州锐博生物科技有限公司合成 3 引物和探针 Real-time PCR 引物和探针由TaKaRa公司合成 hTERT 引物为 正义5-CCGTCTGCGTGAGGA GATC-3 反义5-TCCGGTAGAAAAAGAGCCTGTT-3 hTERT Taqman探针 5 FAM - GGCCAAGTTCCTGCA CTGGCTGACT- TAMARA 3 GAPDH引物 正义5-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3 反义5’-GTTGCTGTAGCC AAATTCGTTGT -3 GAPDH Taqman探针 5 FAM -AACAGCGACACCCACTCCTCCACC Eclipse -3 4 细胞培养和转染 乳腺癌细胞株MCF-7接种在10%新生小牛血清 100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的培养 基中 置于37 5%CO2培养箱内培养 胰酶消化传代 细胞转染时 取对数生长期的MCF-7细胞 以合适的细胞 浓度接种在6孔培养板 用含10%血清不含抗生素的DMEM培养液 37 5%CO2温育过夜 次日转染 转染操作按 LipofectamineTM 2000 Reagent说明书进行 siRNA与脂质体分别用适量不含血清和抗生素的Opti-MEM培养基稀释 5 min后混合 室温静置20min后加入细胞板孔中 置37 5%CO2培养箱培养 12h后在荧光显微镜下观察转染效率 确定最佳的转染条件 5 hTERT mRNA表达的Real-time PCR检测 分别收集各组转染48 h后的细胞 提取总RNA 测定浓度 并逆 转录成cDNA 取RT产物作为模板 进行real-time PCR检测 Real-time PCR反应体系为